单细胞测序在克隆进化中的应用

第三期线上直播肿瘤克隆进化生信分析培训课程报名啦癌症中的克隆进化7个外显子测序的克隆进化快速搞定4分文章单细胞测序在癌症中的应用转化研究是连接基础发现与临床应用的桥梁。癌症分型推动了许多进展包括生物标志物的发现和疾病过程的特征分析。这些信息有助于我们更好地检测和监测疾病、将患者分组纳入临床试验以及对抗治疗耐药性。在此我们概述了癌症研究中四个重要的单细胞测序应用肿瘤进化、治疗耐药性、微小残留病MRD和意义未明的克隆性造血CHIP。肿瘤进化单细胞测序的一个日益增长的应用是重建肿瘤进化史。由于单细胞分析可将突变分配给不同的克隆因此可以根据共突变模式重建系统发育树。 重组克隆历史不仅揭示了进化的整体模式线性与分支还使研究人员能够了解疾病进展的其他重要方面。例如可以识别出启动疾病的突变以及相互排斥和共同发生的模式。评估赋予细胞适应性优势的合作突变尤其具有启发性。例如在图 1 所示的AML系统发育中共突变DNMT3A和NPM1使一个克隆深蓝色圆圈得以扩张并构成肿瘤的约30%。利用单细胞分析进行的系统发育研究为癌症研究提供了宝贵的见解。例如Miles等人2020揭示了突变获得的时间顺序以及驱动克隆扩张的合作突变。该研究还发现进化模式在疾病进展的不同阶段有所不同。在另一项AML研究中Morita等人2020发现了线性和分支进化模式其中一些亚克隆独立地在相同基因中获得突变趋同进化。这两项研究中的蛋白质基因组学分析能够在进化背景下同时表征突变谱和细胞类型/状态。这些研究为癌症的行为提供了新的见解。这些努力不仅为恶性转化提供了基础性知识而且越来越多的证据表明它们具有预后价值。例如肿瘤内异质性较高与AML中耐药性的发生和较差的预后相关。仅在血液学领域就有多个适应症正在积极研究中包括骨髓增生异常综合征CH、急性髓系白血病AML、骨髓增殖性肿瘤MPN、骨髓增生异常综合征MDS、多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞白血病CLL和急性淋巴细胞白血病ALL。随着对更多患者肿瘤的分析进化的一般模式可能会逐渐显现。进化分析揭示了克隆动态在这棵急性髓系白血病AML系统发育树中早期突变DNMT3A和NPM1为克隆性而后续突变FLT3和NRAS为亚克隆性。还可观察到克隆扩增事件黄色圆圈DNMT3A-NPM1-FLT3突变体深蓝色圆圈DNMT3A-NPM1突变体。图 1治疗抗性在肿瘤学众多单细胞测序应用中利用单细胞数据识别治疗耐药机制在个性化医学中具有巨大潜力。尽管抗肿瘤疗法常能将患者带入完全缓解状态但肿瘤往往会在稍后复发。未能彻底消除癌症通常归因于疾病的异质性和动态性。肿瘤细胞可通过原发性耐药逃避治疗即预先存在的突变提供保护性特性或者通过治疗过程中获得的突变产生继发性耐药。由于大多数肿瘤细胞会因治疗而死亡存活下来的细胞资源竞争较少。少量初始耐药细胞可迅速扩增并引发复发。肿瘤以这种方式适应的能力是治疗失败的根本原因。尽管癌症规避治疗的惊人能力仍是重大挑战但理解这一过程可能使我们能够以其人之道还治其人之身。单细胞DNA测序相比传统整体分析具有显著价值。由于整体分析无法明确界定不同克隆中的突变共现情况因此无法确定某种疗法是否能靶向所有克隆。单细胞DNA测序可早期检测高风险克隆从而调整治疗方案以降低复发可能性。为说明单细胞分析的价值考虑一项对接受靶向FLT3抑制剂吉列替尼治疗的复发性AML患者进行的纵向研究图 2。在患者治疗期间使用整体NGS在三个时间点诊断时、治疗期间和复发时检测了外周血。由于整体分析无法解析克隆结构因此无法确定每个时间点存在的克隆。在回顾性研究中通过单细胞DNA测序分析血液样本揭示了肿瘤结构。 初始研究中缺乏克隆分辨率意味着导致复发的克隆被遗漏。例如在诊断时间点浅蓝色克隆被吉列替尼有效靶向而深蓝色克隆未被靶向因其缺乏FLT3靶点。后者在治疗后扩增并导致复发。同样在治疗期间出现的新克隆红色通过NRAS突变获得了对吉列替尼的耐药性。该克隆在治疗期间仅占肿瘤的0.1%整体NGS无法检测到因此得以不受阻碍地扩增并导致复发。克隆结构是抗药机制的基础利用单细胞数据制定个性化治疗策略有望降低复发率。通过在治疗前解析肿瘤的克隆结构可以开发联合疗法以确保所有克隆均被靶向。治疗期间的监测也有助于识别任何新出现的耐药克隆。越来越多的研究正利用单细胞DNA测序在临床试验中揭示耐药机制进一步凸显了这项技术在治疗领域的潜力。一项回顾性研究通过单细胞DNA测序在三个时间点诊断时、治疗期间和复发时对血液样本进行分析。单细胞分析检测到了克隆深蓝色和红色这些克隆最终导致了患者的复发。图 2微小残留病MRD另一种具有影响力的单细胞测序应用是检测体内少量恶性细胞——称为微小残留病MRD。尽管抗肿瘤治疗取得了进展但耐药细胞逃避免疫治疗并引发复发的情况并不少见。即使患者达到完全缓解通常仍会残留少量致病细胞。对于髓系恶性肿瘤而言MRD是治疗结果的强大预测指标。临床试验数据表明MRD的存在预示着更快的复发和更低的整体生存率图3。MRD正逐渐被确立为无复发生存期的替代标志物未来甚至可能作为药物批准的监管终点。鉴于其临床意义MRD检测通常在诱导化疗后进行。如果检测到并表征恶性克隆可以采取早期干预措施。传统上MRD通过基因型或免疫表型来识别。传统的基因分型方法如PCR、qPCR或批量NGS可检测突变频率但无法将异常变异分配给特定克隆。没有这种克隆结构恶性细胞的鉴定将受到限制。MRD也可通过免疫表型分析通常通过多参数流式细胞术检测。例如在急性髓系白血病AML中MRD通过基于原始细胞异常标记表达模式对细胞进行流式分选来识别。然而该检测的灵敏度有限因为常见标记既由健康细胞也由白血病细胞表达。单细胞多组学DNA 蛋白质分析将两种检测方法的优势整合到单一工作流程中。使用多种分析物检测异常细胞可增强残留疾病的检测能力。例如Dillon等人2020报告了一例AML病例其中仅有一半具有恶性基因型的细胞表面存在白血病标记物。在此情况下DNA 蛋白质多组学的应用使MRD的表征比单独使用任何一种分析物都能更全面。在临床上这种高度特异性的信息可用于指导个性化治疗方案。微小残留病MRD状态与临床结局相关在这些假设的Kaplan-Meier曲线中存在MRD的患者复发率较高总生存率较低。图 3不确定潜能克隆性造血CHIP单细胞分析有助于微小残留病MRD的识别但区分病变细胞与良性细胞并非总是明确。对于血液癌症而言单细胞测序的一项相对较新的应用是能够区分具有部分相同突变的恶性细胞与非恶性细胞。像急性髓系白血病AML这样的血液癌症起源于造血干细胞HSCs——这些细胞存在于骨髓中并产生所有后续的血细胞。这些细胞很少分裂因此其基因组相对稳定。然而随着人类年龄增长它们会逐渐获得体细胞突变。特定一组表观遗传调控因子常见如DNMT3A、TET2和ASXL1的突变赋予HSCs竞争优势使其通过一种称为“不确定潜能克隆性造血CHIP”的过程进行克隆性扩增。尽管这些突变导致克隆亚群但这些细胞尚未具有恶性特征也不会引起疾病症状。然而它们容易获得额外突变从而导致完全的白血病转化。因此具有CHIP突变的人被认为有发展为血液恶性肿瘤如骨髓增生异常综合征[MDS]和急性髓系白血病[AML]的潜力。CHIP是一种与年龄相关的进程在约20%的美国人群中发生。表观遗传基因中的体细胞突变变异等位基因频率≥0.02出现在中年并随时间增加图4。19除了发展血液恶性肿瘤的风险更高外CHIP的存在还与心血管疾病风险升高和寿命缩短相关。CHIP随年龄增长而发展CHIP是一种非恶性疾病其特征是血细胞发生突变并形成克隆性扩增通常始于中年。CHIP与较高的血液系统恶性肿瘤和心血管疾病发病风险以及寿命缩短相关。图 4CHIP的病因尚未被充分理解。对于临床医生而言一个特别感兴趣的问题是区分CHIP癌前病变和致癌克隆的能力。由于CHIP细胞中存在的突变也见于白血病细胞中因此两者往往难以区分。然而这些突变的克隆结构可用于验证细胞是否具有致病性。残留疾病的克隆结构可以通过单细胞DNA测序进行评估。作为示例图5展示了一个存在多种低频遗传异常的细胞群体。虽然仅通过VAFs批量NGS的输出结果无法确定肿瘤的亚克隆结构但单细胞DNA测序可以解决这一问题。在此例中两个白血病克隆在16号染色体上存在基因融合AML的特征性表现。而CHIP克隆则存在TET2或ASXL1中的单个突变且这些突变不与16号染色体融合共存表明它们并非白血病性。单细胞分析可区分克隆性造血CHIP克隆仅凭变异等位基因频率VAFs无法区分癌前CHIP克隆和恶性克隆。通过解析各克隆的突变结构单细胞DNA测序能够识别出克隆性造血CHIP克隆和白血病克隆。图 5单细胞DNA蛋白质多组学也可用于区分微小残留病MRD与克隆性造血CHIP克隆。通过整合基因型和免疫表型信息可更可靠地识别恶性与非恶性克隆。事实上Dillon等人2020利用单细胞蛋白质基因组学分析评估了复发性急性髓系白血病AML患者的残留疾病。传统MRD检测方法——基因测序和流式细胞术——结果常不一致而该研究通过结合基因型与免疫表型分析克服了这一局限。借助单细胞多组学技术作者能够明确三位患者的克隆结构并区分CHIP克隆与AML克隆。VocabularyComplete remission (CR): 标准实验室检查和影像学检查未检测到癌症。Primary resistance: 既有的突变赋予对治疗的耐药性。Secondary resistance: 治疗过程中出现的突变会赋予对治疗药物的耐药性。Minimal residual disease (MRD): 治疗后残留在体内的少量癌细胞。也称为可测量残留病灶。Clonal hematopoiesis of indeterminate potential (CHIP): 造血干细胞HSCs发生突变获得并随后克隆扩增的过程导致非恶性克隆的形成。也称为年龄相关性克隆性造血。