跟着Cancer Cell学生信：结直肠癌免疫治疗的单细胞联合分析（scRNA+scTCR-seq）思路

结直肠癌作为高发消化道肿瘤免疫检查点阻断疗法为其治疗带来新希望但不同患者的治疗响应差异显著部分患者甚至无法从中获益背后的细胞和分子机制始终是临床和基础研究的核心难题。友情推荐《Galaxy 生信云平台操作入门及转录组数据分析实战》直播课程原价 799 元现在提供回放视频仅需 99 元。视频学习时间自由安排多数人不需要参加直播。《简说基因》也可以为您提供代分析服务任意 Bulk 转录组项目都只需要 99 元新老学员同享。报名、更多课程或数据分析项目咨询联系微信usegalaxy2024年7月8日《Cancer Cell》杂志发表了北京大学张泽民团队的研究成果该团队通过时空单细胞分析解析了结直肠癌患者对PD-1阻断疗法不同响应的细胞动力学机制。今天我们就来拆解一下这篇生信文章Spatiotemporal single-cell analysis decodes cellular dynamics underlying different responses to immunotherapy in colorectal cancer。研究概述本研究纳入22例接受PD-1阻断治疗的结直肠癌患者收集治疗过程中不同时间点的血液、癌旁正常组织和肿瘤组织样本开展单细胞RNA测序和单细胞T细胞受体测序。研究绘制了结直肠癌患者PD-1阻断治疗下局部肿瘤微环境和全身免疫系统的时空动态图谱鉴定出与治疗响应相关的协同细胞程序发现肿瘤反应性样CD8 T细胞Ttr-like的基线浸润水平、血液相关亚型丰度以及循环CD8 T细胞中MHC II相关特征与治疗效果密切相关为结直肠癌免疫治疗的响应预测和方案优化提供了细胞和分子层面的依据。实验设计研究招募20例结直肠癌患者和2例十二指肠癌患者除1例患者接受二线免疫治疗外其余均接受新辅助PD-1阻断治疗根据治疗后肿瘤退缩程度和临床响应将患者分为完全缓解组CR12例、部分缓解组PR7例和疾病稳定组SD3例。采集患者基线、治疗中及治疗后多个时间点的外周血、癌旁正常组织和肿瘤组织样本共获得169份匹配样本对样本进行单细胞RNA测序scRNA-seq和单细胞T细胞受体测序scTCR-seq同时结合多重免疫荧光染色、流式细胞术等实验技术辅以生物信息学分析和小鼠模型验证系统分析局部和全身免疫细胞的时空动态变化。研究结果图1解析PD-1阻断治疗下结直肠癌患者的单细胞跨组织动态图谱发现响应组患者肿瘤组织基线T细胞浸润水平显著高于非响应组且不同响应组免疫细胞丰度动态变化存在差异。图2鉴定出肿瘤微环境中三种核心协同细胞程序TLS样程序、组织重建程序、肿瘤富集程序不同程序的活性动态与治疗响应状态相关CR组和PR组呈现出相反的程序活性变化特征。图3证实肿瘤浸润耗竭CD8 T细胞Tex的基线比例和克隆扩增程度与肿瘤退缩正相关CR组治疗后Tex丰度和克隆扩增水平降低PR组则升高该规律在非小细胞肺癌数据集中得到验证。图4发现Ttr-like细胞的表型和动态变化与治疗响应相关CR组治疗后Ttr-like细胞中前体耗竭亚型Texp占比升高终末耗竭亚型Text减少PR组则两种亚型均累积。图5揭示血液相关Ttr-like细胞具有低耗竭、高效应的表型特征CR组肿瘤组织中血液相关Ttr-like细胞丰度显著高于PR组且基线水平即存在差异。图6发现循环CD8 T细胞的克隆多样性、MHC II相关基因表达特征可区分CR和PR患者基于HLA-DRA、HLA-DQA1等基因构建的预测评分能有效预测治疗响应且流式细胞术验证了HLA-DR蛋白表达与响应的关联。图7构建了结直肠癌PD-1阻断治疗下局部肿瘤微环境和外周免疫系统的响应模型整合了细胞程序、Ttr-like细胞动态、外周免疫特征与治疗响应的关系。数据分析生信分析本研究涉及的组学技术包括单细胞RNA测序scRNA-seq、单细胞T细胞受体测序scTCR-seq并开展了组学联合分析各技术对应的分析流程及联合分析方案如下scRNA-seq分析• 数据预处理使用Cell Ranger将测序reads比对至GRCh38参考基因组生成UMI矩阵通过Seurat进行质量控制过滤低质量细胞UMI数、检测基因数异常线粒体基因占比过高采用NormalizeData进行文库大小校正和对数转换。• 降维与聚类筛选前2000个高可变基因去除总UMI数和线粒体基因占比的批次效应通过PCA降维利用BBKNN去除样本批次效应再经UMAP进行可视化降维采用两轮无监督聚类Leiden算法先鉴定T细胞、B细胞等主要细胞类型再对各主要类型进行亚群细分结合经典标记基因进行细胞注释。• 差异表达分析使用Seurat的FindMarkers函数通过t检验结合Benjamini-Hochberg校正筛选不同细胞群、不同治疗阶段间的差异表达基因。• 组织富集分析计算各细胞亚型在不同组织中的观察值/期望值Ro/e结合卡方检验和皮尔逊残差分析细胞亚型的组织富集特征。• 基因集评分通过AddModuleScore函数计算耗竭评分、Texp评分、细胞毒性评分、MHC II相关特征评分等。scTCR-seq分析• 数据预处理利用Cell Ranger组装TCRα和β链的CDR3核苷酸序列过滤获得高置信、全长、有功能的序列为每个细胞分配有效TCR对。• 克隆型分析将具有相同TCRα/β对的细胞定义为同一克隆型采用STARTRAC指数量化CD8 T细胞的克隆扩增程度通过熵值计算循环CD8 T细胞的克隆多样性。组学联合分析• 基于TCR克隆型追踪scRNA-seq鉴定的Ttr-like细胞在单细胞水平关联细胞的转录组表型和TCR克隆特征分析Ttr-like细胞的克隆演化和表型转换。• 结合scRNA-seq的基因表达数据和scTCR-seq的克隆型信息鉴定血液相关Ttr-like细胞分析其跨组织的克隆分布和转录组特征。此外生信分析还包括非负矩阵分解NMF鉴定肿瘤微环境细胞程序、CellChat分析细胞间相互作用、LASSO回归构建治疗响应预测评分、CellTypist进行细胞表型映射等分析方法。统计分析采用Pearson相关分析评估细胞亚群间的相关性利用单因素方差分析ANOVA比较多组间差异独立样本t检验比较两组间差异均进行FDR校正或Bonferroni校正通过F检验分析变量间的线性关联采用受试者工作特征曲线ROC及曲线下面积AUC评估预测评分的效能使用留一交叉验证LOOCV优化LASSO回归模型参数。所有统计分析结果以中位数、四分位数、均值±标准误等形式呈现P0.05为差异具有统计学意义。总结研究意义本研究绘制了结直肠癌新辅助PD-1阻断治疗下局部和全身免疫系统的高分辨率时空单细胞图谱突破了以往对离散细胞群的单独研究鉴定出肿瘤微环境中与治疗响应相关的协同细胞程序明确了Ttr-like细胞尤其是血液相关亚型的表型和动态变化在治疗响应中的核心作用发现了循环CD8 T细胞中MHC II相关特征这一非侵入性的治疗响应预测标志物。研究结果不仅揭示了结直肠癌免疫治疗响应的细胞和分子机制还为临床中结直肠癌患者的免疫治疗响应分层、预测标志物开发以及治疗方案的优化提供了新的靶点和思路同时为其他实体瘤的免疫治疗研究提供了参考范式。文章复现这篇文章的原始数据和生信分析代码都公开了非常全面。组学数据编号• 结直肠癌scRNA-seq处理后数据GEO: GSE236581• 原始FASTQ文件Genome Sequence Archive: PRJCA018173• 头颈部鳞状细胞癌参考数据GEO: GSE200996• 非小细胞肺癌参考数据GEO: GSE179994、GEO: GSE176022生信分析:• 代码仓库地址https://github.com/yqq-chen/CRC_ICB• 单细胞数据交互式分析平台http://crc-icb.cancer-pku.cn/推荐课程中国银河生信云平台UseGalaxy.cn致力于零代码生信分析。平台拥有海量计算资源、3000 多个生信工具和数十条生信流程并且为用户提供 200G 免费存储空间。进群交流请先加 usegalaxy 为好友。我们还为进阶用户提供高质量培训课程转录组数据分析实战仅需99元视频版