基于纳米流式检测技术解析灭菌工艺及品种来源对牛乳细胞外囊泡理化性质及生物学功能的影响

基于纳米流式检测技术解析灭菌工艺及品种来源对牛乳细胞外囊泡理化性质及生物学功能的影响摘要牛乳细胞外囊泡（milk-derived extracellular vesicles, mEVs）是一类由乳腺上皮细胞分泌的纳米级双层膜囊泡，携带蛋白质、核酸和脂质等生物活性分子，在细胞间信号传递和免疫调节等方面发挥关键作用。工业灭菌工艺（巴氏杀菌和超高温瞬时灭菌）及品种来源差异可能显著影响mEVs的结构完整性、分子组成和生物学功能，但传统表征方法因检测灵敏度限制难以实现单颗粒水平的精准解析。本研究以荷斯坦牛和娟姗牛生乳、巴氏杀菌乳及UHT乳为研究对象，建立基于超速离心与尺寸排阻色谱联用的mEVs高效分离纯化流程，应用纳米流式检测技术（nano-flow cytometry, nFCM）对mEVs的粒径分布、颗粒浓度及四跨膜蛋白（CD9、CD63、CD81）表达进行单颗粒水平多参数表征，结合透射电镜、蛋白质免疫印迹及miRNA测序分析，系统解析灭菌工艺与品种来源对mEVs理化性质及生物学功能的影响。基于R/Bioconductor构建了完整的数据分析流程，涵盖粒径数据统计建模、流式数据补偿校正、差异表达分析和功能富集等模块。结果表明，UHT处理导致mEVs浓度降低70%，CD63阳性率从生乳的78.5%降至23.6%，且miRNA载量显著减少，而巴氏杀菌对粒径和标记蛋白表达的影响相对温和；娟姗牛mEVs在粒径和CD9表达丰度上显著高于荷斯坦牛。本研究揭示了工业灭菌工艺对mEVs的梯度性损伤规律，为功能性乳制品的工艺优化和品种筛选提供了理论依据和数据支撑。关键词：纳米流式检测技术；牛乳细胞外囊泡；灭菌工艺；品种差异；生物