基于TR-FRET技术的BCL-xL/VHL PROTAC降解剂在抗肿瘤治疗中的研究

一、BCL-xL靶向治疗面临的挑战BCL-xL是BCL-2家族的重要抗凋亡蛋白在多种癌细胞中过度表达是一个具有明确效果的抗肿瘤治疗靶点。然而BCL-xL也是血小板赖以生存的蛋白靶向该蛋白的抑制剂往往对血小板产生较大的毒副作用。ABT263作为BCL-2/BCL-xL双重抑制剂虽具有抗肿瘤活性但血小板毒性限制了其临床应用。为解决这一问题研究者利用PROTAC技术对ABT263进行改造保留其与靶蛋白结合的部分连接E3连接酶配体设计了新型降解剂DT2216。TR-FRET BCL-xL/VHL PROTAC试剂盒可用于定量检测PROTAC分子与BCL-xL和VHL的双重结合活性为降解剂筛选提供技术工具。二、DT2216的设计策略与选择性降解机制DT2216同时与BCL-xL和E3连接酶结合通过E3连接酶使靶蛋白泛素化利用泛素蛋白酶系统降解靶蛋白。为克服血小板毒性问题研究者选择的E3连接酶是VHL。VHL在多种肿瘤细胞中表达量高包括急性淋巴细胞白血病、肝癌、结肠癌和前列腺癌细胞但在血小板中表达量很低可借此减少降解剂对血小板的毒性。DT2216对BCL-xL具有特异性降解作用对BCL-2和MCL-1无影响。蛋白组学结果显示DT2216只减少BCL-xL水平对其他蛋白水平无显著影响。TR-FRET技术可应用于研究DT2216与BCL-xL和VHL的协同结合评估其诱导靶蛋白降解的选择性。三、DT2216的体外抗肿瘤活性与血小板毒性DT2216在MOLT-4 T-ALL细胞中可明显降解BCL-xL蛋白半数最大降解浓度为63 nM最大降解率可达90.8%。而在血小板中这种降解作用不明显半数最大降解浓度大于3 μM最大降解率仅26%。DT2216可有效杀死肿瘤细胞其半数效应浓度为52 nM相比改造前的抑制剂ABT263杀伤肿瘤细胞的活性提高了近四倍而对血小板的毒性大大降低。有趣的是DT2216与BCL-2可结合并具有高亲和力在细胞外蛋白结合实验中BCL-2和BCL-xL均能与DT2216及VHL形成稳定的三元复合物但在活细胞内的蛋白结合实验中BCL-2不能形成三元复合物。四、DT2216的体内抗肿瘤效果与安全性在动物实验中腹腔注射给药后肿瘤组织中的DT2216浓度显著超过半数效应浓度可维持约10天长时间抑制靶蛋白水平。研究者比较了DT2216和ABT263对小鼠血小板水平的影响。ABT263给药后约6小时血小板降至极低浓度随后缓慢回升第3天超出正常水平第10天恢复正常此过程中可能出现自发性出血或血栓。相比之下DT2216对血小板的作用较温和未出现反弹增高情况。同时DT2216显著抑制肿瘤组织生长抗肿瘤活性强于ABT263。TR-FRET BCL-xL/VHL PROTAC试剂盒可用于评估DT2216与BCL-xL和VHL的结合亲和力为其体内活性评价提供数据支持。五、DT2216的联合治疗策略部分肿瘤细胞同时表达多种抗凋亡蛋白如小细胞肺癌H146同时表达BCL-2和BCL-xL。将DT2216与BCL-2抑制剂ABT199联用抗癌效果显著增强联合指数为0.166表示强的协同作用。DT2216与MCL-1抑制剂联用在细胞实验中协同作用明显但在小鼠实验中导致死亡因为肝细胞依赖MCL-1和BCL-xL生存。DT2216与ABT199联用的抗癌效果高于双重抑制剂ABT263且对血小板毒性更小。在病人来源的复发性难治性急性T淋巴细胞白血病模型中DT2216与ABT199联用或与传统化疗药物联用抗癌效果强于单独用药延长了小鼠中位生存时间。六、DT2216克服化疗耐药的应用BCL-xL蛋白被证明与细胞耐药性相关。DT2216可增加耐药乳腺癌细胞对化疗药的敏感性增强多西紫杉醇、长春新碱和阿霉素的抗癌作用这种效应在前列腺癌、肝癌、结肠癌模型中也被观察到。通过降解BCL-xLDT2216可逆转肿瘤细胞对多种化疗药物的耐药性为克服临床耐药问题提供了新策略。TR-FRET BCL-xL/VHL PROTAC试剂盒可用于评估不同PROTAC分子的降解活性指导克服耐药的联合治疗策略开发。七、TR-FRET技术在BCL-xL降解剂研发中的应用TR-FRET技术结合了时间分辨荧光和荧光共振能量转移两种检测原理。时间分辨荧光利用镧系元素螯合物的长寿命荧光特性有效消除短寿命的背景荧光干扰。荧光共振能量转移发生在供体与受体荧光分子距离足够近时通过非辐射能量转移产生特异性信号。在BCL-xL/VHL PROTAC试剂盒中将供体荧光分子标记的BCL-xL蛋白与受体荧光分子标记的VHL蛋白共同孵育当PROTAC分子同时结合两者时供体与受体距离拉近发生能量转移。该检测方法具有均相、免洗、高灵敏度和高通量的特点适用于大规模化合物筛选。