原代人肝细胞长期培养模型研究：全人源三培养体系（TCS）对PHHs功能维持的影响

摘要原代人肝细胞Primary Human HepatocytesPHHs是药物代谢、药理学及毒理学研究中的核心模型但传统培养体系难以长期维持其形态与代谢功能。本文基于全人源三培养体系TCS的公开研究资料系统介绍原代人肝细胞长期培养方法、胆小管网络形成、白蛋白与尿素分泌、细胞色素P450CYP活性维持以及Ⅰ相与Ⅱ相代谢功能等关键结果为药物研发、DILI研究及体外肝模型构建提供参考。关键词原代人肝细胞PHHs三培养体系TCS肝细胞长期培养肝细胞培养体系细胞色素P450CYP3A4药物代谢毒理学研究肝脏模型胆小管网络药物筛选DILI体外肝模型一、引言原代人肝细胞PHHs在临床前药理学和毒理学研究中的应用受到一定限制部分原因是缺乏便捷的合适培养体系。理想的肝细胞培养体系通常需要满足以下条件操作简便能支持不同供体来源细胞可长期维持肝细胞结构与功能适用于药物代谢与毒理学研究维持细胞极性与CYP活性传统三明治培养Sandwich CultureSC体系与共培养体系虽然能够部分改善肝细胞状态但依然存在一定局限性例如肝细胞功能随时间下降CYP酶活性衰减细胞极性难以长期维持供体差异较明显因此研究人员开发了全人源三培养体系Tri-Culture SystemTCS用于长期维持原代人肝细胞的形态与代谢功能。二、什么是全人源三培养体系TCSTCS体系采用原代人肝细胞PHHs两种原代人源饲养细胞FCs共同构建培养环境。与传统使用小鼠或大鼠来源饲养细胞的体系相比TCS具有全人源体系更接近人体微环境更适合药物代谢研究更适合长期培养等特点。研究中将两种基质饲养细胞按照1:1比例混合后接种于24孔胶原包被板再加入冻存原代人肝细胞从而构建完整三培养体系。三、TCS体系研究中的主要结果在为期3周至6周的培养过程中研究人员重点评估了肝细胞形态白蛋白分泌尿素分泌胆小管形成CYP酶活性药物代谢能力等指标。结果显示1、PHHs在TCS中可长期维持稳定形态来自多个成人供体的原代人肝细胞在TCS中能够长期保持健康形态形成多细胞簇稳定培养长达42天相比传统SC体系TCS中肝细胞状态更加稳定。2、胆小管网络形成稳定培养初始5天内PHHs逐渐形成交织胆小管网络并形成紧密连接缝隙连接这些结构对于肝细胞极性药物转运胆汁分泌具有重要意义。3、白蛋白与尿素分泌明显提高研究显示与SC体系相比TCS中的PHHs白蛋白生成水平达到30–40 μg/天/10⁶细胞尿素生成水平达到55–70 μg/天/10⁶细胞说明TCS更有利于维持肝细胞功能。4、CYP基因表达明显增强培养第4天TCS中的CYP1A2CYP2B6CYP3A4Alb等基因表达平均高于SC体系约2倍。说明TCS对于药物代谢功能解毒功能CYP酶活性维持具有明显优势。5、Ⅰ相与Ⅱ相代谢长期稳定第5天后TCS中咪达唑仑1-羟化葡萄糖醛酸化硫酸化等功能可稳定维持至少2周。说明TCS不仅维持肝细胞形态也能够长期维持代谢功能稳定性。四、当前肝细胞培养体系面临的问题目前肝细胞体外模型依然面临诸多挑战。1、动物模型存在物种差异动物模型虽然广泛应用于药理毒理研究但CYP代谢差异核受体差异药物反应差异会影响结果外推。2、传统SC体系功能下降较快传统单培养或三明治培养体系中PHHs通常会出现极性丢失CYP下降代谢功能减弱等问题。3、非人源共培养体系局限明显许多共培养体系使用小鼠细胞大鼠细胞作为饲养层。这会带来物种干扰信号差异代谢偏差等问题。而TCS采用全人源体系因此更适合药物开发DILI研究长期毒性研究ADME研究等方向。五、TCS体系搭建流程实验流程图1 三培养体系搭建步骤具体步骤1、培养基制备包括过夜解冻添加补充剂37℃预热整体耗时约30分钟。2、饲养细胞接种包括解冻计数接种FCs耗时约60分钟。3、原代人肝细胞接种包括解冻PHHs计数接种整体约需2–4小时。4、培养基更换每日更换培养基。六、检测方法解析研究中采用了多种检测方式用于评估肝细胞功能CYP活性代谢稳定性等指标。七、蛋白表达检测通过免疫细胞化学法检测ZO-1Connexin-32CK18白蛋白AlbCYP1A2VimentinVIM等蛋白表达。同时使用CDFDA对胆小管进行染色。胆小管与蛋白标志物表达图3 三培养体系TCS中胆小管形成及蛋白标志物表达结果显示ZO-1阳性Connexin-32阳性CK18阳性说明肝细胞维持了较好的极性细胞连接功能状态八、白蛋白与尿素检测通过ELISA比色法分别测定Alb尿素水平。功能验证结果图5 三培养体系TCS中原代人肝细胞功能验证结果显示相比SC体系TCS中Alb生成更高尿素水平更高功能维持时间更长九、CYP酶活性检测研究采用奥美拉唑CITCO利福平等诱导剂检测CYP1A2CYP2B6CYP3A4活性。CYP诱导结果图6 三培养体系TCS中CYP1A2、CYP2B6及CYP3A4诱导情况结果显示TCS中CYP活性长期稳定多供体间一致性较好诱导能力明显优于SC体系十、Ⅰ相与Ⅱ相代谢功能验证Ⅰ相代谢采用咪达唑仑Midazolam作为探针。检测1’-羟基咪达唑仑OH-MDZ生成量。Ⅱ相代谢采用7-乙氧基香豆素7-EC检测葡萄糖醛酸化硫酸化等功能。结果显示TCS中Ⅰ相与Ⅱ相代谢功能可长期稳定维持。十一、TCS长期稳定性分析长期培养结果图4 三培养体系TCS的长期稳定性研究中PHHs在无Matrigel条件下仍能够长期维持形态长期维持CYP活性长期维持Alb与尿素水平时间可达42天。十二、PHHs与FCs比例优化研究还分析了PHHs与FCs不同接种比例。最佳比例分析图2 三培养体系TCS中适宜PHHs与FCs比例结果显示适宜比例有助于维持CYP活性提高长期稳定性提高功能维持能力十三、供体适用性分析研究中多个成人供体PHHs均能够在TCS中保持健康形态保持代谢功能长期维持CYP诱导能力说明TCS具有较好的供体适用性与重复性。十四、结论综合研究结果全人源三培养体系TCS具有以下特点长期维持PHHs形态长期维持Alb与尿素功能稳定维持CYP活性支持Ⅰ相与Ⅱ相代谢维持胆小管网络结构适用于多供体来源PHHs因此TCS是一种便捷、稳定、可重复的原代人肝细胞长期培养体系适用于药物研发DILI研究ADME研究药物代谢肝毒性评估临床前毒理学等方向。参考文献LeCluyse E.L., Witek R.P., Andersen M.E., Powers M.J., 2012. Organotypic liver culture models: Meeting current challenges in toxicity testing.Olson H., Betton G., Robinson D., et al., 2000. Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and animals.Khetani S.R., Bhatia S.N., 2008. Microscale culture of human liver cells for drug development.Ware B.R., Durham M.J., Monckton C.P., Khetani S.R., 2017. A Cell Culture Platform to Maintain Long-Term Phenotype of Primary Human Hepatocytes and Endothelial Cells.本文基于公开研究资料整理仅用于科研信息分享。本文关于人肝细胞PHHs、肝细胞培养基、长期培养体系及相关药物代谢与毒理学研究解决方案支持DILI研究、ADME研究及肝脏体外模型构建应用。