抗IL-3R-α阻断抗体处理的肿瘤来源内皮细胞外泌体（EVs）的抗血管生成效应：对Wnt/β-catenin通路的洞察

引言血管生成即从已有血管中形成新血管的过程是肿瘤生长和转移的关键过程。肿瘤微环境中的促血管生成因子在促进这一过程中起着关键作用。在这些因子中具有促血管生成特性的细胞因子白细胞介素-3IL-3由乳腺癌和卵巢癌微环境中的炎症细胞释放。除了其旁分泌效应外IL-3还在人乳腺癌和肾肿瘤中作为TECs的自分泌因子进一步驱动血管生成。细胞外囊泡EVs是由细胞分泌的小型膜结合囊泡可将包括蛋白质、脂质和核酸在内的生物活性分子传递给受体细胞从而介导细胞间通讯。我们之前的研究表明IL-3处理的内皮细胞ECs释放的EVs可作为对邻近ECs的旁分泌机制促进血管生成。在本研究中我们旨在探讨抗IL-3R-α阻断抗体对TECs释放的EVs抗IL-3R-EVs促血管生成特性的影响。方法2.1 细胞培养与EVs分离从人乳腺癌和肾肿瘤组织中分离TECs并在体外培养。使用超速离心法从经或未经抗IL-3R-α阻断抗体处理的TECs的条件培养基中分离EVs。2.2 miRNA分析使用miRNA微阵列和定量实时PCRqRT-PCR分析原生TECs来源的EVsEVs和抗IL-3R-EVs的miRNA含量。使用生物信息学工具鉴定差异表达的miRNA并预测其潜在靶标。2.3 体外和体内血管生成测定使用人脐静脉内皮细胞HUVECs的管形成测定在体外评估EVs和抗IL-3R-EVs的促血管生成效应。在体内在裸鼠中进行Matrigel栓塞测定以评估新生血管的形成。2.4 蛋白质印迹和免疫荧光使用蛋白质印迹和免疫荧光染色分析经不同EVs处理的TECs中Wnt/β-catenin通路相关蛋白包括β-catenin、APC、GSK3β和c-myc的表达水平。结果3.1 抗IL-3R-EVs在体外和体内抑制血管生成在体外管形成测定表明与原生EVs相比抗IL-3R-EVs显著降低了HUVECs形成管状结构的能力。在体内Matrigel栓塞测定表明抗IL-3R-EVs处理可防止新生血管的形成更重要的是可诱导TECs来源的新生血管退化。3.2 靶向Wnt/β-catenin通路的miRNA的差异调控比较EVs和抗IL-3R-EVs的miRNA含量时发现靶向Wnt/β-catenin通路的两种miRNA的差异调控。直接靶向β-catenin的miR-214-3p在抗IL-3R-EVs中上调而靶向APC和GSK3β的miR-24-3p下调。3.3 miRNA调控对Wnt/β-catenin通路的影响当转移到TECs中时抗IL-3R-EVs、pre-miR-214-3p-EVs和antago-miR-24-3p-EVs导致低水平的β-catenin和高水平的“β-catenin降解复合体”的两个成员APC和GSK3β。此外在经这些EVs处理的TECs中发现Wnt/β-catenin通路的下游靶标c-myc下调这与miR-214-3p和miR-24-3p的网络分析预测的基因靶向一致。3.4 体内验证miRNA对血管生成的影响在裸鼠中的体内研究表明用pre-miR-214-3p-EVs和antago-miR-24-3p-EVs处理可损害血管生长如Matrigel栓塞中血红蛋白含量减少所示。当采用pre-miR-214-3p-EVs和antago-miR-24-3p-EVs的联合治疗时这些效应更为显著。讨论本研究的结果为TECs来源的EVs促血管生成效应的机制以及靶向IL-3R-α/Wnt/β-catenin通路的潜在治疗益处提供了新的见解。我们已经表明抗IL-3R-α阻断抗体可以改变TECs来源的EVs的miRNA货物从而在体内和体外抑制血管生成。抗IL-3R-EVs中miR-214-3p和miR-24-3p的差异调控表明这些miRNA与Wnt/β-catenin通路之间存在复杂的相互作用。miR-214-3p通过直接靶向β-catenin降低这一关键蛋白的水平从而抑制Wnt/β-catenin通路的激活。另一方面靶向APC和GSK3β的miR-24-3p下调导致这些Wnt/β-catenin通路负调控因子的水平增加进一步抑制其活性。在经抗IL-3R-EVs、pre-miR-214-3p-EVs和antago-miR-24-3p-EVs处理的TECs中Wnt/β-catenin通路的下游靶标c-myc下调为该通路参与TECs来源的EVs促血管生成效应提供了额外证据。c-myc是一种众所周知的癌基因可促进细胞增殖和血管生成其抑制可有助于本研究中观察到的抗血管生成效应。体内对miRNA血管生成效应的验证进一步支持了靶向IL-3R-α/Wnt/β-catenin通路的治疗潜力。用pre-miR-214-3p-EVs和antago-miR-24-3p-EVs处理的动物血管生长受损尤其是当联合使用时突出了这些miRNA在抑制血管生成中的协同效应。此外我们的研究表明通过改变TECs-EVs-miRNA货物IL-3R阻断在抑制原生TECs来源的EVs促血管生成效应方面可能比miRNA靶向具有显著优势。IL-3R阻断可同时影响Wnt/β-catenin通路内的多个靶标从而更全面地抑制血管生成。结论总之本研究确定了经典Wnt/β-catenin通路是TECs来源的EVs促血管生成效应的相关机制。抗IL-3R-EVs中miR-214-3p和miR-24-3p的差异调控为IL-3R阻断抗血管生成效应的分子基础提供了新的见解。此处提供的证据表明通过改变TECs-EVs-miRNA货物IL-3R阻断可能是一种有前景的抑制肿瘤血管生成的治疗策略。需要进一步研究以探索这种方法的全部潜力并开发用于癌症治疗的新型抗血管生成疗法。