如何进行DAP-seq的数据挖掘，筛选验证位点

从样本准备到寄送公司，每一天都在“祈祷”有个心仪的分析结果，终于在这天随着邮件提示音的响起，收到了分析结果......

分析前工作

爱基在进行数据分析之前，会有两次质控报告反馈给老师们。第一个，基因组DNA的提取质控报告（图1）：保证DNA的完整性以及足够的量进行后续的富集亲和纯化；第二个，富集建库报告：构建DNA文库，利用磁珠富集与加完halo Tag标签表达的目的蛋白结合DNA片段，并纯化获得IP文库。这个过程中，为了检测蛋白表达的正常，爱基利用抗体对富集产物进行 WB 检测，同样对于文库也会进行质检（图2）。

图1 DNA提取质控报告

图2 WB结果显示目的蛋白表达正常

分析思路

  第一部分

数据预处理：去接头序列、污染序列、低质量碱基，获得clean data序列，并进行相关数据统计；

  第二部分

参考基因组比对：将clean data定位到参考基因组上，得到bam文件，并去除重复序列，保留唯一比对的序列；

  第三部分

call peak： 将bam文件进行Peak检测，得到富集区域的信息，并进行Peak在基因功能元件的分布，最近基因寻找及motif预测。

  第四部分

Peak分析：统计Peak分布情况，对Peak最近基因进行GO、KEGG功能注释与富集及转录因子预测等。

图3 DAP分析流程

纵览整个本地分析结果，peak和motif可谓是重中之重。爱基结果“03.peak”中包含了peak的长度统计、peak在功能元件分布饼图、peak在基因组上的分布情况（是否有染色体偏好）以及关键peak的reads分布图，以上这些分析图也是在文献中普遍会见到的。而“06.motif”的结果则包含了大量潜在结合基序信息，从中老师们可以筛选到心仪的验证位点。

如何筛选验证位点

1. 从基因角度出发

在“03.peak/01.peak_annotation”表格中记录着peak的详细信息，包括：在染色体上具体位置、长度、峰顶所在染色体的位置、显著性、富集倍数、落在某个基因的哪个位置、统计距离最近基因以及这些基因的在不同数据库的注释结果。

如果前期做过其它实验或者通过文献查找已经有了关注基因，那么直接搜索基因id找到对应的peak，通过获得的peak编号在“06.Motif”文件夹的ecxel表格中找到匹配Peak的motif就可以考虑验证啦~

如果没有做过上述调查，可以现在基因注释列（GO、KEGG、NR......）搜索与自己课题相关的关键词。比如，抗旱研究可以搜索活性氧、激素（ABA、GA）等。锁定到与研究内容相关的gene，同行对应上peak，再和上述方式一致根据peak找到motif。

总之，这种方式逻辑是从gene→peak→motif。

2. 直接锁定基序

可以直接看motif网页版结果中的match Details，有无基序在数据库中已经被收录匹配目标转录因子（homerResults中看Best Match/Details；KnownResults中看Name列）。

以“sna/MA0086.2/Jaspar(0.681)”为例，其含义是这个比对结果来自Jaspar数据库的sna转录因子，MA0086.2是Jaspar的编号，可通过这个具体编号找到对应sna-motif信息（当没有MA编号时，可以直接搜索转录因子的名称），0.681代表该denovo motif与这个sna-motif的序列相似打分。如果研究的是sna就可以优先关注这个基序啦。

除此之外，软件会自动按照显著性排序，将更显著的排在前列；碱基复杂程度低的、只有2个碱基不断重复的，不建议优先考虑哦。

注：Known和homer 是两种不同的motif预测算法，结果都是可信的。Known motif基于已有转录因子数据库的motif结果，比对本次的peak有没有在这些已有的研究motif上富集；homer result是指利用所有的peak从头（de novo）计算得到motif，然后会比对已有转录因子数据库的motif，看比对率最一致的是哪个（bestmatch）。两者不一定一致（因为motif序列是一组序列模式，相似的序列可能会被归为同一个motif）。

扩   展

通过上述的方式已经锁定了想要验证的基因位点后，还需要确定下motif在基因/基因启动子区真实存在的碱基信息哦。参考：【干货分享 | 一文GET寻找motif在序列上的定位】

想要更多了解，欢迎各位老师前来咨询哦~