玉米植物结构受乙烯生物合成基因 ZmACS7 的调控

摘要：

植物高度和叶片角度是玉米（Zea mays）植物结构的两个关键决定因素，与高种植密度下的抗倒伏性和冠层光合作用密切相关。这两个性状主要由几种植物激素调节。然而，乙烯在调节玉米植物结构中的机制，特别是植物高度和叶片角度，尚不清楚。在此，我们对一个玉米突变体Semidwarf3（Sdw3）进行了表征，该突变体比野生型表现出更矮的植株和更大的叶片角度。组织学分析显示，节间纵向细胞伸长的抑制和叶耳细胞伸长的促进是导致Sdw3突变体植株高度降低和叶片角度增大的主要原因。通过定位克隆，我们鉴定出一个转座子插入到候选基因ZmACS7中，该基因编码玉米乙烯生物合成中的1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）合酶7。转座子改变了ZmACS7的C末端。转基因分析证实，突变的ZmACS7基因赋予了Sdw3突变体的表型。酶活性和蛋白质降解实验表明，Sdw3突变体中ZmACS7的改变的C末端增加了该蛋白的稳定性，但不影响其催化活性。Sdw3突变体中的ACC和乙烯含量显著升高，导致植株高度降低和叶片角度增加。此外，我们还证明了ZmACS7在根发育、开花时间和叶片数量中发挥着重要作用，表明ZmACS7是玉米生长和发育过程中一个具有多效性的重要基因。

材料与方法

植物材料

玉米（Zea mays）Sdw3 突变体来源于田间的自发突变。选择杂合突变体 Sdw3/2 自交五代以生成近等基因系（NILs）N18（野生型）、Sdw3/2（杂合突变体）和 Sdw3（纯合突变体）。Sdw3 的近等基因系和转基因生成的株系，包括 PC 株系、ZmACS7 OX 株系和 ZmACS2 OX 株系，于 2015 年和 2017 年夏季在中国北京（40.1°N, 116.2°E）种植。转基因 pZmACS7L329:ZmACS7Sdw3 T0 植物在温室中种植。ZmACS7 KO 株系和转基因 L329’ 株系（补充图 S6）于 2019 年夏季在中国北京（40.1°N, 116.2°E）种植。

定位克隆

将 Sdw3 与自交系 P11、B73 和 Z58 进行杂交，并将 F1 代回交其相应的野生型亲本以开发三个 BC1 群体。初步定位使用 86 个均匀覆盖整个玉米基因组的分子标记（www.maizegdb.org）。利用 96 个 P11 小群体，目标基因最初定位在玉米第 10 染色体长臂的分子标记 p-bnlg1250 和 IDP8334 之间。开发了 10 个分子标记 M1 到 M10 进行精细定位，如补充表 S1 所示。利用 1404 个 P11 大群体，将 Sdw3 位点进一步定位在分子标记 M3 和 M10 之间。随后，筛选了超过 10,000 个 Z58 和 B73 群体个体，最终将 Sdw3 位点缩小到分子标记 M8 和 M9 之间的 8 kb 区间。

RNA提取和RT-qPCR分析

收集不同玉米品系在不同发育阶段的各种组织，分别切成小块，立即冷冻在液氮中，并储存在-80°C。每个组织样本有三个独立的生物重复，每个生物重复至少包含六株个体植物。使用植物RNA分离试剂盒（www.huayueyang.com.cn/）按照制造商的说明从样本中提取总RNA。使用FastKing RT试剂盒（www.tiangen.com/）将总RNA（1微克）逆转录。使用7500 Fast和7500实时PCR系统（Applied Biosystems）和SYBR Premix Ex Taq试剂盒（www.takara.com.cn/）进行RT-qPCR。ZmActin1（GRMZM2G126010）用于样本之间的标准化。RT-qPCR使用的引物列在补充表S1中。使用ΔΔCT方法测量目标基因的相对表达水平（Livak和Schmittgen，2001）。所有数据基于三个独立的生物重复和四个技术重复。

系统发育分析和蛋白质序列比对

从Gramene数据库（www.gramene.org）获取五个注释的玉米ACS同工型和11个拟南芥（Arabidopsis thaliana）ACS同工型的全长蛋白质序列；AtACS3作为假基因被排除。这16个序列使用MEGA版本6.0中嵌入的ClustalW进行比对，采用默认参数。使用邻接法（neighbor-joining method）和Poisson模型以及1000次自举重复构建系统发育树（Tamura等，2013）。使用DNAMAN v6软件（www.lynnon.com/）中嵌入的多序列比对程序进行蛋白质序列比对。在某些情况下，在自动比对后进行精细的手动调整，以生成锚定比对以突出重要基序。

内源ACC和乙烯水平的定量

为了测量内源ACC，分别收获在V7阶段的Sdw3和N18幼苗的从第7片叶子和第8片叶子之间发育中的节间、第8片叶子的叶鞘、以及第8片和第9片叶子的发育中的叶舌区域。每个样本从六株个体植物中收集，并在液氮中粉碎。使用内标法，每个样本约200毫克的新鲜植物组织用于提取内源ACC，通过QTRAP 5500 LC-MS/MS系统（AB SCIEX；Xin等，2020）测量。

内源乙烯水平的测量方法基于之前的描述，稍作修改（Habben等，2014）。在V7阶段，收获N18和Sdw3幼苗的第七片和第八片叶片，并使用打孔器制作小圆盘（直径6.33毫米）。圆盘在25°C下孵育2小时，以使伤害引起的乙烯产生减少。每个样本的100个圆盘密封在带橡胶盖的20毫升顶空瓶中。孵育16小时后，通过气相色谱法（Shimadzu GC-17A）测量瓶中的乙烯水平。最后，将叶片圆盘干燥并称重，以评估9个生物重复的标准化乙烯水平。

外源ACC和乙烯利处理

N18和Sdw3种子在10%（v/v）H2O2溶液中表面消毒30分钟，用无菌水冲洗五次，并在湿的滤纸上在28°C的黑暗中发芽36小时。发芽的种子在无菌蛭石中播种，并在光照培养箱中培养1周（相对湿度60%；光照26°C，14小时；黑暗24°C，10小时）。手工去除幼苗的胚乳，并将一片发育良好的叶子的均匀幼苗转移到装满完全浓度Hoagland溶液（pH 6.0）的18升不透光塑料箱中，溶液中含有0.5 mM (NH4)2SO4、2mM Ca(NO3)2、0.25 mM KH2PO4、0.75 mM K2SO4、0.65 mM MgSO4、0.1 mM KCl、1 mM MnSO4、1 mM ZnSO4、0.1 mM CuSO4、0.005 mM (NH4)6Mo7O24、1mM H3BO3、0.1 mM FeSO4和0.1 mM EDTA-Na。将ACC或AVG的储备溶液加入塑料箱中，并在Hoagland溶液中稀释至相应浓度（0、1、10和100 mM ACC；0和0.1 mM AVG）。幼苗在人工气候室中培养3周（相对湿度60%；光照26°C，14小时；黑暗24°C，10小时）；每3天更换一次培养液。第五片叶子完全发育后，收获所有处理的株系进行形态观察和定量测量。由于玉米幼苗的高度主要由叶鞘长度决定，测量了第五片叶鞘的长度和第五片叶的角度。

N18和Sdw3种子于2019年夏季在中国北京（40.1°N, 116.2°E）种植。从V7阶段开始，每周喷洒N18植物的叶子各种浓度的乙烯利（250、500和750 ppm；每株植物20毫升），直到雄穗出现。对照植物喷洒相同量的酸性双蒸水（pH 5 2.5），因为工作溶液中含有250、500和750 ppm乙烯利的pH值分别为2.79、2.56和2.42。在开花时，测量植株高度、穗位高度、主穗上第二节间的长度和主穗上第一片叶子的角度。

质粒构建和植物转化

为了生成 pZmACS7L329:ZmACS7Sdw3 构建体，从转基因受体 L329 的基因组中扩增出含有 2660 bp ZmACS7 推测天然启动子的 4172 bp DNA 片段，以及从 Sdw3 突变体的互补 DNA 文库中扩增出的 1512 bp ZmACS7 编码序列，并将其克隆到 pCAMBIA3300M 载体中。值得注意的是，我们研究中使用的 ZmACS7 推测启动子已提交至国家生物技术信息中心 (NCBI) 的 GenBank 数据库。改变 CTD 和敲除 ZmACS7 的 CRISPR/Cas9 质粒按照之前描述的方法构建（Xing 等，2014）。简而言之，分别设计了两个位于 ZmACS7 转座子插入位点和翻译起始位点附近的特异性 19 bp Cas9 引导序列（补充图 S7A 和 S15A），使用 CRISPR-P (http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR) 并将其引入 pBUE411 载体。筛选并排除了转基因衍生的 PC 和 KO 突变体中的 Cas9 构建体引入序列。此外，为构建过表达质粒 (Ubi:ZmACS7 和 Ubi:ZmACS2)，将 B73 的 ZmACS7 和 ZmACS2 的完整编码序列融合到由玉米泛素启动子驱动的 pBCXUN 载体中（来自中国农业大学作物功能基因组和分子育种中心 [CAU]）。克隆使用的引物列在补充表 S1 中。pZmACS7L329:ZmACS7Sdw3 构建体、用于扰动 ZmACS7 (PC) 的 CTD 和敲除 ZmACS7 (KO) 的 CRISPR/Cas9 质粒，以及过表达 ZmACS7 和 ZmACS2 (OX) 的 Ubi:ZmACS7 和 Ubi:ZmACS2 构建体被转化到 L329 中，由 CAU 作物功能基因组和分子育种中心完成。pZmACS7L329:ZmACS7Sdw3 构建体也被引入转基因受体 B104 中。

重组蛋白的制备

从 N18 和 Sdw3 植物中提取的 ZmACS7 的整体编码序列，以及分别表达 N18 和 Sdw3 的 ZmACS7 CTD 的截短 DNA 序列，以及缺少 VHAS 基序的 CTD 独立地与 pColdTF 载体中的 HIS 标签序列融合（www.takarabiomed.com.cn/）。使用的引物列在补充表 S1 中。空载体和五个重组质粒随后被转化到大肠杆菌 BL21 菌株中以进行诱导表达。按照产品手册使用 ProteinIso Ni-IDA 树脂（www.transgen.com.cn/）纯化表达的蛋白质。使用增强 BCA 蛋白质测定试剂盒（www.beyotime.com/）测量纯化蛋白质的浓度。

ZmACS7特异性酶活性测定

特异性酶活性测定使用约8 pmol新纯化的HIS-ZmACS7N18和HIS-ZmACS7Sdw3融合蛋白在11.7毫升顶空瓶中进行，反应瓶中含有0.5毫升反应缓冲液（50 mM Tris-HCl，4 mM二硫苏糖醇，20 mM吡哆醛5-磷酸和150 mM SAM [pH 8.0]），在30°C下反应30分钟。加100微升20 mM HgCl2终止反应后，将样品在冰上预冷3分钟。加入100微升1:1（v/v）冷混合的商业NaClO（10% [w/v]有效氯）和饱和NaOH后，立即用橡胶盖密封反应瓶，并在冰上孵育3分钟，孵育期间摇动一次。使用气相色谱法检测瓶顶空中的乙烯水平（GC-17A，Shimadzu；Luo等，2014）。

无细胞蛋白降解测定

无细胞蛋白降解测定按照Wang等（2018b）的描述进行，并稍作修改。收获10天龄的野生型B73幼苗，并在液氮中研磨成细粉。使用含有50 mM Tris-HCl，0.5 M蔗糖，1 mM MgCl2，10 mM EDTA，5 mM二硫苏糖醇和1 mM ATP的降解缓冲液（pH 8.0）提取总蛋白。通过两次10分钟的离心（12,000g，4°C）去除细胞碎片，并通过Miracloth（Calbiochem）过滤上清液。收集提取物并补充50 mM MG132（APExBIO）或作为对照的二甲基亚砜。新纯化的HIS-CTDN18（300 ng），HIS-CTDSdw3（308.5 ng）和HIS-CTDDVHAS（298.1 ng，与HIS-CTDN18和HIS-CTDSdw3相同摩尔量）蛋白与100微升总蛋白提取物（约500微克总蛋白）孵育。蛋白降解反应在25°C水浴中进行，并在不同时间点加入SDS-PAGE装载缓冲液终止反应。使用抗HIS抗体通过免疫印迹分析检测HIS-CTD蛋白丰度，并使用ImageJ软件（imagej.nih.gov/ij/）定量条带强度。

转录组分析

在V7阶段，分别采集N18和Sdw3幼苗的第7片叶子和第8片叶子之间发育中的节间以及第8片叶子和第9片叶子的发育中的叶舌区域进行总RNA提取，每个样本有三个生物重复。使用Illumina HiSeq mRNA构建方法进行文库构建，并在Illumina HiSeq 4000平台上进行测序。RNA-seq数据分析按照之前描述的方法进行（Trapnell等，2012）。简而言之，在去除低质量碱基和接头序列后，将干净的数据映射到玉米基因组（AGPv3）上，使用TopHat v2.1.0（ccb.jhu.edu/software/tophat/）。RNA-seq数据标准化为每百万映射片段的每千碱基外显子片段数。使用Cufflinks软件包组装转录本，比较并合并组装，并识别差异表达基因（DEGs）。当将Sdw3与N18进行比较时，使用表达水平变化超过两倍且假发现率q值小于0.05的标准筛选DEGs。从节间和叶舌区域的转录组中随机选择两个子集的15个DEGs，通过RT-qPCR验证RNA-seq数据的可靠性。用于验证DEGs相对mRNA水平的RT-qPCR引物列在补充表S1中。

首先使用MapMan软件基于功能注释文件“Zm_B73_5b_FGS_cds_2012”（https://mapman.gabipd.org）对节间和叶舌区域的DEGs进行全球视图分析，并从Gramene数据库（www.gramene.org）获取详细的基因注释。然后我们人工选择并分组分析与乙烯生物合成、信号传导和响应相关的基因，决定细胞伸长的基因，调节叶角的基因以及决定玉米开花时间的基因，以分析DEGs的表达模式与表型变化之间的相关性。