易基因特异性R-loop检测整体研究方案

大家好，这里是专注表观组学十余年，领跑多组学科研服务的易基因。

01.技术简述

R-loop是由DNA:RNA 杂交体和被置换的单链DNA组成的三链核酸结构，广泛参与基因转录、表观遗传调控及DNA修复等关键生物学过程。异常的R-loop积累会导致基因组不稳定性，与癌症、神经退行性疾病及自身免疫性疾病密切相关。

技术痛点：传统方法难以精准区分R-loop与非特异性RNA结合，且无法解析其转录方向性。

02.R-loop研究解决方案

DRIP-seq

( DNA:RNA Hybrid Immunoprecipitation Sequencing）：基于S9.6抗体特异性识别RNA:DNA 杂交链，通过免疫沉淀富集R-loop区域，结合NGS测序实现全基因组覆盖。

优势：

✅ 高特异性：S9.6抗体精准捕获DNA:RNA 杂交体，避免假阳性。

✅ 高灵敏度：高灵敏度定位全基因组R-loop分布。

✅无酶干扰：不依赖内切酶消化，保留天然R-loop结构。

✅ 广泛兼容性：适用于细胞、组织、血液、植物等多种样本类型。

DRIPc-seq（DRIP with cDNA Sequencing）：

在DRIP-seq基础上，对免疫沉淀的RNA链进行cDNA建库，明确R-loop中RNA来源链及转录方向。

R-loop CUT&Tag：

利用S9.6抗体引导Tn5转座酶靶向切割R-loop区域，直接在DNA片段两端添加测序接头，无需免疫沉淀步骤。

03.典型案例

案例1:

DRIP-seq+ChIP-seq揭示AMPK缺失导致的异常表观遗传修饰通过形成异常R-loop结构影响基因组稳定性，并导致生殖缺陷[1]

期刊：Nucleic Acids Research

影响因子：IF 16.6

样本：秀丽隐杆线虫（C. elegans）

本研究通过染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）和DNA:RNA免疫沉淀测序（DRIP-seq）联合分析揭示了AMP激活蛋白激酶（AMPK）在饥饿条件下通过调控H3K4me3沉积和R-loop形成来维持基因组稳定性和生殖细胞完整性的机制。AMPK缺失导致的异常表观遗传修饰和R-loop积累不仅影响当前代，还会跨代传递，导致生殖缺陷和基因组不稳定性。这些发现为理解环境应激与表观遗传修饰之间的关系提供了新的见解，并可能对人类生殖健康和癌症研究产生重要影响。

案例2：

DRIP-seq和DRIPc-seq通过基于S9.6的DNA-RNA免疫沉淀高通量测序进行高分辨率、链特异性R-loop定位[2]

期刊：NATURE PROTOCOLS

影响因子：IF 13.1细胞

样本：骨骼肌

本研究通过DRIP-seq和DRIPc-seq进行R-loop定位，结果表明该技术可以检测任何感兴趣的基因组中R-loop结构的稳态分布。更重要的是，这些方法可用于由遗传突变（基因敲除或敲低）或化学处理（药物/激素）引起的整体R-loop分布或动态变化。已发表的例子包括人乳腺癌细胞对雌激素转录诱导的反应或沉默人HEK293细胞中DNA拓扑异构酶1的后果。利用DRIPc-seq在小鼠细胞和酵母中成功地检测到了R-loop谱。

04.易基因项目经验

05.参考文献

① Sun B, Sherrin M, Roy R. Unscheduled epigenetic modifications cause genome instability and sterility through aberrant R-loops following starvation. Nucleic Acids Res. 2023 Jan 11;51(1):84-98. pii: 6887602. doi: 10.1093/nar/gkac1155.

②Sanz LA, Chédin F. High-resolution, strand-specific R-loop mapping via S9.6-based DNA-RNA immunoprecipitation and high-throughput sequencing. Nat Protoc. 2019 Jun;14(6):1734-1755. pii: 10.1038/s41596-019-0159-1. doi: 10.1038/s41596-019-0159-1.

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