兔抗PHLPPL抗体亲和纯化，IP/WB双平台验证，精准检测Akt调控因子

一、产品概述由艾美捷Bethyl Laboratories推出的兔抗PHLPPL抗体亲和纯化抗体货号A300-661A是一款以兔为宿主来源、针对人PHLPPL蛋白的多克隆抗体。该抗体采用抗原亲和纯化工艺制备以完整IgG形式提供浓度为200 µg/ml未偶联任何标记物适用于免疫沉淀及免疫印迹实验。抗体同时识别小鼠和人类来源的PHLPPL具有跨物种反应性是Akt信号通路研究中重要的检测工具。二、靶点信息PHLPPL / PHLPP2PHLPPLPH domain leucine-rich repeat-containing protein phosphatase-like亦称PHLPP2属于PH结构域和富含亮氨酸重复序列的蛋白磷酸酶家族。该蛋白的核心功能是去磷酸化并失活Akt——Akt是调控细胞存活与凋亡平衡的关键信号分子。通过使Akt去磷酸化PHLPPL可触发细胞凋亡并抑制肿瘤细胞生长。PHLPPL与PHLPP1功能相似两者协同作用通过靶向特定的Akt亚型选择性终止Akt信号通路。PHLPPL也被称为PHLPP2或PPM3B蛋白磷酸酶Mg²⁺/Mn²⁺依赖性3B。三、免疫原与特异性本抗体识别的表位位于人PHLPPL蛋白第1275位至C末端第1323位区域之间参考序列NP_055835.2GeneID 23035。具体免疫原设计针对1273至C末端区域该区域对应蛋白的C末端结构域。抗体采用固相载体上固定的表位特异性肽段进行亲和纯化确保对PHLPPL的高特异性识别避免与PHLPP1或其他含PH结构域或亮氨酸重复序列的蛋白发生交叉反应。四、产品规格与储存参数 | 详情靶点 | PHLPPL / PHLPP2反应性 | 小鼠、人宿主 | 兔克隆性 | 多克隆形态 | 全IgG亚型 | IgG偶联物 | 未偶联纯度 | 抗原亲和纯化抗原种属 | 人浓度 | 200 µg/ml缓冲液 | 含0.1% BSA及0.09%叠氮钠的Tris缓冲盐水储存条件 | 2–8°C有效期 | 自收货起1年浓度测定采用比尔定律测定免疫球蛋白浓度其中1 mg/ml IgG在280 nm波长的吸光度为1.4。五、应用与推荐稀释度应用 | 推荐用量/稀释度 | 备注免疫沉淀 | 6 µg/mg 裂解物 | 每毫克总蛋白使用6 µg抗体免疫印迹 | 1:2000 – 1:10,000 | 推荐起始稀释度1:2000六、免疫印迹操作要点通用条件封闭液及抗体稀释液5% Milk-TBST不可使用BSA牛奶封闭效果更佳一抗孵育过夜overnight推荐4°C或室温细胞裂解液WB检测二抗推荐山羊抗兔IgG重轻链抗体A120-101P免疫沉淀产物WB检测二抗推荐抗兔IgG轻链HRP偶联抗体避免重链干扰封闭缓冲液添加5%正常猪血清货号S100-020以降低非特异性背景七、技术要点与优化建议1. 目标蛋白分子量与凝胶选择PHLPPL/PHLPP2的分子量约为132–140 kDa基于氨基酸序列。在WB检测中推荐使用6-8% SDS-PAGE凝胶或4-12%梯度胶转移条件湿转建议300 mA恒流2-3小时或4°C过夜可使用PVDF膜或NC膜PVDF结合力更高2. 免疫沉淀的关键优化抗体用量6 µg/mg总蛋白裂解物是经验证的标准用量。若蛋白表达量低可适当增加至8-10 µg/mg。裂解液选择推荐使用含蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% 脱氧胆酸钠, 0.1% SDS可有效释放核及细胞质蛋白。裂解物浓度建议使用1-2 mg总蛋白进行IP确保目标蛋白丰度。洗涤严格性使用含0.1% Tween-20的TBS或PBS洗涤3-5次每次5分钟以降低非特异性条带。3. 二抗选择的关键考量在检测IP产物的WB时常规抗兔IgG二抗会同时识别抗体的重链~55 kDa和轻链~25 kDa。由于PHLPPL分子量为132-140 kDa远大于重链和轻链重链信号不会直接干扰目标条带。但若实验涉及近分子量50-60 kDa的目标蛋白则必须使用轻链特异性二抗以避免干扰。本产品信息仍建议IP-WB中使用轻链HRP二抗以降低背景提高信噪比。4. 叠氮钠的注意事项缓冲液中含有0.09%叠氮钠作为防腐剂。如计划对抗体进行偶联标记如生物素或HRP需注意叠氮钠会抑制标记反应建议使用前通过透析或脱盐去除。