细胞培养之一二三：哺乳动物细胞培养污染问题和解决方案

一、哺乳动物细胞污染是什么[1]？

        污染通常是指在细胞培养基中存在不需要的微生物、不需要的哺乳动物细胞和各种生化或化学物质，从而影响所需哺乳动物细胞的生理和生长。由于微生物在包括人体特定部位在内的环境中无处不在，而且它们的繁殖速度比哺乳动物细胞最快的生长速度要快得多，因此微生物污染对哺乳动物细胞培养提出了重大挑战。污染哺乳动物细胞培养物的最重要的微生物是细菌、真菌(酵母/霉菌)、支原体、病毒和原生动物。虽然细菌和真菌污染是最常见和最容易看到的，但支原体和病毒污染很难发现，无法用肉眼确认。原生动物的污染是非常罕见的。除了微生物之外，另一个可能污染哺乳动物细胞培养物的对象是不需要的哺乳动物细胞（例如，HeLa细胞）。不需要的哺乳动物细胞污染的原因是在培养过程中错误标记，一次处理多个细胞，在液氮中从培养瓶中去除标签等。

        污染是细胞培养技术的主要威胁，因为在大多数情况下，污染的细胞需要丢弃，这造成了巨大的金钱损失和人力浪费。因此，不仅在细胞培养实验室中创造一个无菌环境，而且在培养过程中保持高度谨慎是非常必要的。因此，了解各种类型的污染、它们的识别和可能的消除是至关重要的。

二、常见的污染类型[2]

       1、微生物是最常见的污染类型。细菌和真菌在充满培养基的培养皿中生长非常快，它们在培养基中的存在会减缓或杀死哺乳动物细胞的生长。由于培养的细胞没有防御或免疫力，单个细菌或真菌孢子的感染可能导致培养物完全污染。培养物中微生物的存在可以通过在显微镜下检查细胞或通过培养基的颜色或浊度的变化来检测。

       2、交叉培养污染是由哺乳动物细胞培养物被其他哺乳动物细胞污染引起的其他类型的污染。这种类型的污染是哺乳动物细胞培养领域的一个重大问题。一种培养物被不同类型的细胞污染可能极难检测，研究人员可能多年都没有注意到，导致对实验的错误解释。

      3、化学污染可能由血清、杂质或介质中的有毒分解产物引入，甚至由水中的杂质引入。有毒的化学污染会导致细胞生长不良或死亡。

三、支原体污染的解决方案[3]

       支原体是细胞培养中常见的动物细胞污染物。大约有25种支原体和支原体已被确定为细胞培养污染物，但最常见的是赫氏支原体、口腔支原体、精氨酸支原体和莱氏支原体。在细胞培养中，这些物种造成了85%的污染。支原体和哺乳动物细胞核酸代谢的差异，支原体对核酸前体有营养需求，而核酸前体可以由嘌呤和嘧啶碱基或核苷来满足。另一方面，哺乳动物细胞中游离嘧啶的含量很少，因此，在受污染的细胞培养物中，游离碱基（如尿嘧啶）的含量被用来检测支原体。其中一种可以选择性地结合到支原体核酸中的碱基类似物是5-溴酸（5-BrUra）。可见光诱导含有5- brura的DNA10断裂，荧光染料33258-Hoechst与DNA11结合可大大提高这种光敏性。其异常高的A+T含量使支原体DNA3成为5-BrUra、33258-H和光联合作用诱导断裂的极好候选者，因为33258-H对A−T碱基对具有高亲和力，对A - brura碱基对具有更高亲和力。用这种方法治疗它们为选择性杀灭污染支原体提供了一种实用而简单的方法；它们很可能因为DNA断裂而死亡。

四、细菌污染的现象和解决方案[3]

       在感染后几天内，通过目视检查培养物很容易发现细菌污染，受感染的培养物通常出现浑浊，有时会在表面形成一层薄膜；也经常出现培养基pH值突然下降的情况；在低倍显微镜下，细菌表现为在细胞之间移动的微小颗粒，在高倍显微镜下观察时可以分辨出单个细菌的形状。

        一旦出现污染迹象，可观察培养基、胰酶、PBS等颜色，澄清度是否正常，确定有污染后可立即弃去培养容器内的培养基，以PBS润洗2~3次，加入胰酶处理至细胞形态略有改变但未脱离容器时弃去胰酶，加入PBS轻轻润洗一遍。其次要加入20×双抗，浸泡细胞3~5分钟，弃去双抗。再次加入新鲜的完全培养基（含10×双抗）培养12小时，然后12小时弃去培养基以PBS润洗2~3遍后加入完全培养基（含10×双抗）。而在传代时以较小转速离心，仍以含10×双抗的培养基培养。若第二代后镜下找不到细菌，则第三代起可正常培养，正常培养48小时后无反弹则可认为污染已清除。

          卡梅德生物（KMD Bioscience）(https://www.kmdbioscience.cn/)已建立了完善的哺乳表达体系，包括但不限于FreeStyle 293-F 细胞系、Expi 293-F细胞系、Expi-CHO-K1和Expi CHO-S等细胞系，配合卡梅德设计的高表达载体（含有全长的CMV启动子以及优化后的分泌信号肽序列），能够为客户提供更高表达水平的重组蛋白哺乳动物细胞表达与制备。

1. Lincoln C K , Gabridge M G .Chapter 4 Cell Culture Contamination: Sources, Consequences, Prevention, and Elimination[J].Methods in Cell Biology, 1998, 57:49-65. DOI:10.1016/S0091-679X(08)61571-X.
2. Rammurti,Kamble,Shubham,et al.Microbial contamination of hematopoietic progenitor cell grafts—incidence, clinical outcome, and cost-effectiveness: an analysis of 735 grafts[J]. Transfusion, 2005. DOI:10.1111/j.1537-2995.2005.04178.x.
3. Anthony,O,Olarerin-George,et al.Assessing the prevalence of mycoplasma contamination in cell culture via a survey of NCBI's RNA-seq archive.[J].Nucleic Acids Research, 2015. DOI:10.1093/nar/gkv136.

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