不同类型的生物反应器在支架成熟过程中具有哪些特点和应用？

3D Bioprinting of Human Tissues: Biofabrication, Bioinks, and Bioreactors是发表于《International Journal of Molecular Sciences》的一篇综述，详细介绍了3D生物打印人体组织的相关技术进展，包括数据处理、生物打印技术、生物墨水配方、生物反应器等方面，最后讨论了该领域的现存局限性和未来发展方向。

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一、引言

1.1 背景

组织工程是一个多学科领域，旨在开发人工生物组织替代物，用于再生医学和药物研究。传统的组织工程方法使用三维预制支架作为基质来负载细胞，但这些方法在模仿生物组织的复杂微结构和定义细胞的空间位置及分布方面存在局限性。

1.2 3D生物打印的优势

3D生物打印作为一种新兴技术，有望彻底改变组织工程和再生医学领域。它通过精确放置活细胞和生物材料来创建复杂的复合组织构建物，具有以下优势：

能够以微米级精度沉积生物材料，对支架制造和细胞分布具有有效控制。

为创建具有复杂微结构和功能的组织替代物提供了新的可能性。

1.3 3D生物打印体外组织的步骤

1.3.1 预处理：

细胞培养：从人体中分离特定细胞并在体外扩增，以获得大量细胞。

模型设计：利用磁共振（MRI）或计算机断层扫描（CT）成像技术获取目标组织的结构和形态信息。

模型重建：将记录的图像重建为3D生物打印模型，并转换为可被生物打印机读取的文件格式，如gcode。

1.3.2 处理：

生物墨水制备：选择合适的生物材料、细胞和生长因子制备生物墨水。

3D生物打印：使用基于喷墨、激光或挤出的生物打印系统，根据MRI或CT扫描的组织模型，引导打印3D细胞负载支架。

1.3.3 后处理：

支架成熟：将细胞负载支架置于生物反应器中进行体外成熟培养，以增强所需组织构建物的发育。

应用：3D生物打印的人体组织可用于移植、药物发现和体外疾病研究等领域。

二、技术方法

2.1 数据处理

3D生物打印始于计算机辅助过程，用于设计定义明确的3D生物模型。具体步骤如下：

使用计算机辅助设计软件（如CAD、Solidwork）创建3D模型，或从医学影像（如MRI和CT）中导入数据。

软件设计的3D模型数据具有更大的设计自由度，例如晶格和圆形模型。使用患者特定组织的尺寸和形态生成的3D模型能够创建更接近人体组织的定制化3D构建体。

将3D模型转换为标准 tessellation 语言（STL）文件，并保存为g - code等文件格式，以便打印机能够读取并指导生物元素的逐层沉积。

2.2 生物打印技术

几种增材制造技术已被用于制造3D支架，其中喷墨式、激光辅助和挤出式生物打印常用于制造人体组织的3D细胞负载支架，每种技术都有其特定的优势、劣势和局限性，具体如下：

2.2.1 喷墨式生物打印：

原理：喷墨生物打印于2003年首次发表，与传统的2D喷墨打印非常相似。喷墨生物打印机将控制量的生物墨水输送到所需的打印表面，使内容物连续流动（连续喷墨打印）或从喷嘴中滴落（按需喷墨打印）。细胞负载的生物溶液存储在墨盒中，电子控制的升降台提供喷墨打印机中Z轴的控制。在生物打印过程中，打印机头用作热或压电致动器，在基板上产生液滴，这些液滴可以支持或形成最终细胞负载构建体的一部分。

优势：包括高通量能力、高分辨率、低成本、可重复性和相对较高的细胞存活率（> 90％）。此外，该技术可用于将多种细胞或蛋白质沉积到目标空间位置，允许制造复杂的多细胞构建体。

劣势：生物墨水必须处于液态且具有适当的粘度才能从喷嘴的小孔中喷射出来，这限制了材料的选择。

2.2.2 激光辅助生物打印：

原理：起源于激光直接写入技术，是激光诱导正向变换技术的改进版本，用于转移生物材料，如肽、DNA和细胞。典型的激光辅助生物打印机由五个元素组成：脉冲激光束、聚焦系统、包含对激光刺激响应的能量吸收层的“带状”结构供体层、液体生物墨水溶液层和用于图案化和交联生物墨水的接收基板。

优势：在生物打印过程中，生物墨水与分配器之间没有直接接触，可防止细胞受到应力，从而导致高细胞存活率（> 95％）。此外，激光辅助生物打印兼容不同类型的生物墨水和广泛的粘度范围（1 - 300 mPa / s），是3D打印细胞负载构建体的有前途的技术。

劣势：激光暴露对细胞的影响尚未完全研究清楚，此外，高设备成本和激光打印控制系统的复杂性是使用该技术的另一个限制。

2.2.3 挤出式生物打印：

原理：该技术结合了流体分配系统和自动化机器人系统，分别用于挤出和打印。流体分配系统可以由气动或机械系统作为“动力源”驱动。通过在生物打印过程中施加连续的力，生物墨水被打印成不间断的圆柱形线条。在自动化机器人系统的控制下，圆柱形细丝可以被精确地制造为所需的3D定制形状结构。

优势：能够打印各种粘度的生物材料，包括水凝胶、生物相容性共聚物和细胞球体，范围从30到6×107 mPa / s。通常，较高粘度的材料通常为打印构建体提供结构支撑，而较低粘度的材料为维持细胞存活率和功能提供合适的环境。

劣势：封装的细胞在打印过程中会暴露于较大的应力下，从而降低细胞存活率。

三、生物墨水配方和关键生物墨水特性

3.1 墨水

生物墨水的组成：用于生物打印的支架材料称为生物墨水，它由生物材料溶液（墨水）、细胞以及存在或不存在的生长因子组成。

生物材料的选择：天然（如明胶、胶原蛋白、纤维连接蛋白、海藻酸盐、壳聚糖、丝素蛋白和透明质酸）或合成聚合物（如聚乙二醇（PEG）、PCL、聚（乳酸 - 共 - 乙醇酸）（PLGA）、聚乳酸（PLA））均可用于组织工程。天然聚合物与人体细胞外基质相似且具有固有生物活性，合成聚合物可根据特定应用定制物理性质。为结合两者优势，一些生物墨水是融合天然和合成材料的杂化生物材料。

脱细胞外基质（dECM）水凝胶：由脱细胞组织制成的水凝胶，如膀胱、心脏、肝脏、真皮、脂肪组织、骨和肺等，被开发并报道可支持不同细胞类型的生长和功能。Pati等人展示了来自三种组织（软骨、心脏、脂肪组织）的dECM可溶解成生物墨水并进行生物打印。dECM生物墨水包含不同组织特有的细胞外基质成分，因此更接近天然组织。尽管dECM生物墨水的低粘度会影响机械性能和形状保真度，但它是生物墨水的有前途的补充。

交联机制：根据已生物打印的多种水凝胶，有化学（离子化合物、pH）、物理（温度、光）和酶促三种交联机制。生物墨水的凝胶化过程有时包括几种交联机制，以打印稳定和复杂的支架。

3.2 细胞选择

干细胞在组织再生中的作用：组织再生是一个精心协调的过程，干细胞在其中发挥主要作用，与生长因子一起。干细胞具有自我更新和分化为多种功能特化细胞类型的能力。

用于工程人体组织的干细胞类型：包括人骨髓间充质干细胞（hMSCs）、脂肪来源的干细胞（ASC）、人羊膜液来源的干细胞（hAFSC）和人骨髓间充质干细胞（hTMSCs）等。

诱导干细胞分化的方法：在大多数情况下，需要在培养基中添加外部补充剂来诱导干细胞向目标细胞表型分化。例如，将干细胞体外分化为成骨细胞和骨细胞谱系需要在细胞培养基中补充特定化合物，称为成骨培养基（包括β - 甘油磷酸盐、抗坏血酸和地塞米松）。

组织特异性细胞类型的应用：另一种生物打印策略是使用组织特异性细胞类型，如骨组织的前成骨细胞和成骨细胞、软骨组织的软骨细胞和脂肪组织的脂肪细胞。这些细胞具有稳定的组织表型，已被用于组织再生。

同时打印不同细胞类型的意义：为了模拟人体组织，不仅需要工程化的复杂构建体，还需要代表组织的细胞类型多样性。3D生物打印技术能够同时以空间准确性打印不同细胞类型的能力引起了人们的极大兴趣。例如，软骨细胞和MSCs或MG63细胞的共培养已被研究用于改善软骨形成和骨形成。

3.3 生长因子选择

生长因子的作用：生长因子是控制细胞生长、增殖、分化等多种反应的可溶性信号分子，通过与靶细胞上的跨膜受体特异性结合发挥作用。使用生长因子促进组织再生的想法是直观的，因为生长因子与受损人体组织的修复高度相关。

常用的生长因子：转化生长因子 - β（TGF - β）、胰岛素样生长因子（IGF）、骨形态发生蛋白（BMP）、血管内皮生长因子（VEGF）和甲状旁腺激素（PTH）等是用于刺激干细胞分化的最广泛使用的生长因子和激素。

生长因子在组织再生中的具体作用：TGF - β超家族在胚胎发育、组织形态发生、细胞增殖和分化中起重要作用。TGF - β1和TGF - β3已被用于MSCs的软骨形成分化和软骨形成表型维持，以促进软骨和骨软骨组织再生。BMPs，特别是BMP - 2、BMP - 4和BMP - 7，是用于诱导异位和原位新骨形成的研究最广泛的成骨分子，包括临界尺寸缺陷。VEGF和IGF可调节血管生成，骨研究中血管生成因子主要关注VEGF在新血管形成和成骨募集中的作用。尽管PTH指导成骨活性的机制尚不完全清楚，但研究表明周期性暴露于PTH可刺激大鼠和人类的骨形成。

3.4 关键生物墨水特性对于3D生物打印人体组织的重要性

生物墨水打印性的影响因素：在选择基础组件（水凝胶、细胞、生长因子）时，需要考虑生物墨水的可打印性。生物墨水是否适合生物打印过程主要取决于其在特定生物打印参数条件下的物理化学性质。其中一个特定的生物打印参数是喷嘴规格，它将决定支架的分辨率、制造速度、时间以及嵌入细胞在打印过程中所暴露的剪切应力。决定生物墨水可打印性的主要物理化学性质是其流变学性质和交联机制。

流变学参数：在流变学参数中，粘度是流体在施加应力时流动的阻力。聚合物的类型、浓度和分子量决定了聚合物溶液的粘度。打印保真度通常随着粘度的增加而增加。然而，粘度的增加意味着施加的剪切应力增加，这可能对悬浮的细胞有害。

交联机制：打印的生物墨水结构的交联或凝胶化对于保持其三维结构的完整性是必要的。交联机制由选择用于打印的水凝胶决定，通常可以是物理的、化学的或两者的组合。物理交联机制依赖于非化学相互作用，包括离子、立体复合物和热交联。物理交联的水凝胶是用于生物打印的最突出的水凝胶类，但一个显著的缺点是其机械性能较差。化学交联形成新的共价键来连接凝胶前体。化学交联可能为水凝胶提供良好的处理性能和高机械强度，但需要非常严格地控制交联动力学。

生物墨水的其他特性：除了可打印性，生物墨水的特性，如生物相容性、生物降解性、机械性能和材料仿生，对于支架成熟以实现功能性人体组织也很重要。生物相容性是指墨水支持正常细胞活动（细胞附着和增殖）而不引起宿主组织炎症或免疫反应的能力。生物降解性是指墨水的理想降解速率应与细胞用其细胞外基质蛋白替代墨水材料的能力相匹配，降解产物应无害且易于从宿主代谢。机械性能是指生物墨水应提供模仿天然骨组织机械性能所需的拉伸强度、刚度和弹性，为细胞提供稳定的附着、增殖和分化环境。材料仿生是指工程生物墨水材料具有特定的生理功能，需要模仿人体组织中细胞外基质成分的天然组织特异性组成和定位。

四、体外生物反应器系统用于支架成熟

4.1 静态培养的局限性

3D生物打印的细胞负载支架通常在孵箱中进行静态培养，培养基需要手动更换。这种静态培养存在一些缺点，如营养物质和氧气的传质限制以及废物清除问题。

4.2 不同类型的生物反应器

为了适应单个细胞或组织的要求，设计了不同类型的生物反应器用于支架成熟，使其能够进行动态培养。选择生物反应器来培养3D细胞负载支架取决于要工程化的组织及其功能性生物力学环境。例如，沃尔夫定律表明，骨强度会随着骨上的机械力增加或减少而增加或减少。下面介绍了几种常见的生物反应器：

4.2.1 Spinner Flask Bioreactor（旋转烧瓶生物反应器）：

结构：由一个带有橡胶塞作为盖子的双侧臂圆柱形烧瓶组成。3D支架穿过连接到烧瓶盖子的针头并浸入培养基中。使用磁搅拌棒或轴来产生细胞培养基对流，为支架周围提供均匀的氧气和营养物质分布。

应用效果：已被证明是一种有效的大规模体外软骨形成分化和体内软骨形成的方法。例如，Mygind等人发现，与静态对照相比，hMSCs负载的羟基磷灰石支架构建体在动态旋转烧瓶培养中导致细胞增殖、分化和分布增加。Stiehler等人在PLGA支架上进行了长达3周的实验，结果显示在旋转烧瓶培养中，DNA含量增加（第21天），ALP特异性活性增强（第7天和第21天），Ca2 +含量更高（第21天），早期成骨标记物的转录水平显著增加。

局限性：剪切应力的大小在不同位置可能有很大差异，因此并非所有细胞都暴露于相同的剪切应力。此外，旋转烧瓶培养成功的原因仍不确定，磁搅拌棒或轴引起的机械刺激可能有助于功能组织的形成。

4.2.2 Rotating - Wall Vessel Bioreactor（旋转壁式生物反应器）：

结构：由两个同心圆柱体组成，其环形空间包含细胞培养基。内圆柱体静止且可渗透，允许CO2气体交换以供应氧气。外圆柱体不可渗透，水平旋转，产生的离心力可平衡重力。连续旋转使细胞在培养基中温和下落并保持悬浮。

应用效果：已用于工程化多种组织模型，包括骨、软骨、肝、神经元组织、心肌、脂肪组织和上皮组织等。例如，Song等人证明，在旋转壁式生物反应器中培养的大鼠成骨细胞比在旋转烧瓶和静态对照中扩增了10倍以上，并且呈现出更好的形态、存活率和更强的形成骨组织的能力。人类软骨祖细胞也已被证明可以使用支架和旋转壁式培养相结合的方式分化为成熟的软骨细胞。心脏组织也已通过旋转壁式培养进行工程化，产生了高度分化的组织，表现出正常的各向异性电生理特性。

局限性：营养物质向支架中心的运输仍然有限，因为对流力无法延伸到大尺寸构建体的内部。外壁的大旋转速度将增加质量传输，而差异旋转的增加会增强支架上的剪切应力。

4.2.3 Compression Bioreactor（压缩生物反应器）：

结构：由一个带有一个或多个活塞的压缩室组成，活塞直接向支架施加压缩载荷。通常，支持设施如机械刺激单元允许控制加载频率、应变、力和时间。

应用效果：旨在模拟体内组织的自然生理加载，在骨和软骨组织工程中应用越来越广泛。例如，Mauck等人证明，在生理应变水平下应用动态变形加载可增强细胞 - 种子琼脂糖支架中软骨细胞基质的形成，从而产生比自由膨胀对照组更具功能的工程化软骨组织构建体。Sittichockechaiwut等人表明，成骨细胞对机械加载高度敏感，与静态条件相比，1 Hz、5%应变的压缩加载对矿化基质产生和成骨相关基因表达有很强的影响。压缩生物反应器的设计和机械加载方案在不同的组织工程中有所不同。

4.2.4 Perfusion Bioreactor（灌注生物反应器）：

结构：提供连续的培养基流过支架，产生剪切应力于细胞。培养基通过直接泵送不断再循环通过腔室，从而改善营养物质和氧气向构建体的运输。

应用效果：在大组织质量构建中非常有用，因为它允许更精确地控制培养环境。例如，Vetsch等人开发了一种灌注生物反应器系统，用于在工程化骨样组织支架上产生剪切应力力，并通过微CT无创且及时地监测矿化细胞外基质的发展。研究表明，曲率对三维矿化基质形成有影响，在灌注条件下矿化组织向通道内的生长更高。大通道在任何组中都没有闭合，而中、小通道在部分（静态）或完全（灌注）闭合。流速是灌注生物反应器系统中组织工程的最重要参数之一，不同的生物反应器设计和细胞类型对最佳流速范围的要求不同。例如，增加流速（0.075 - 0.2 mL / min）至人软骨细胞接种的PLGA支架上长达5周，可增加细胞外基质中糖胺聚糖的保留百分比。Zhao等人通过结合计算流体动力学和机械调节理论，证明了在不同的hMSCs负载的丝素蛋白支架的灌注生物反应器中，诱导矿化的最佳流速范围在0.5 - 5 mL / min之间。生化测定和组织学证实了这些结果，并显示高流速组中增强的成骨分化。

五、现存局限性和未来展望

5.1 局限性

血管化问题：骨是一种代谢活跃的组织，由骨内血管供应。虽然骨移植植入后会自发发生血管生成，但宿主来源的植入物新血管形成速度缓慢（<1mm/天），对于临床相关尺寸的复杂工程3D构建体，仅靠营养物质的扩散是无法维持的，因此创建功能性血管网络对于确保营养供应和废物清除是必要的。

墨水选择：墨水的选择是3D生物打印细胞负载支架用于组织再生的一个主要关注点和限制，所选材料应考虑其与细胞生长和功能的兼容性以及其可打印性特征。许多已发表的研究选择了有限范围的材料，如海藻酸盐、明胶、胶原蛋白、丝素蛋白、壳聚糖、PEG和琼脂糖。同时，每种生物材料都有其特定的优点和缺点，常见的方法是多材料打印，但在创建细胞或生长因子的梯度方面仍然存在挑战，因为需要准备许多独立的溶液。

模拟自然微环境：在天然组织发育和重塑过程中，不同类型的力，如骨组织中的剪切应力和压缩载荷，具有协同作用。为了模拟组织的自然微环境，生物反应器被开发用于对3D细胞负载支架施加组合机械力，但目前的生物反应器仍难以完全模拟体内自然组织的机械加载条件。

5.2 未来展望

5.2.1 血管化的改进：

计算机模拟：使用计算机模拟模型来优化血管网络的设计，将是提高营养和废物效率的有力工具。

微尺度技术：该技术在创建具有嵌入式血管化和毛细血管网络的精确3D结构方面提供了灵活性，通过逐层组装的方式，但这种方法速度较慢，且需要解决细胞在预聚合生物墨水中以及在大尺寸多日打印的早期聚合区域内的存活率问题。

牺牲性打印：使用3D打印牺牲性生物材料，如明胶、Pluronic F - 127和碳水化合物玻璃，来创建血管网络。这些牺牲性材料在制造过程中打印血管化通道并提供机械支持，然后在后期处理步骤中从完成的物体中去除，但这会增加打印过程的复杂性，并且去除方法和分解产物必须与细胞相容。

更高分辨率的生物打印机：更快、更高分辨率的生物打印机将有助于解决一些当前的问题。

5.2.2 墨水的发展：

智能生物材料：开发有前途的自组装材料和刺激响应性水凝胶。自组装是在微观层面上产生材料（纳米颗粒或水凝胶）、细胞和蛋白质以产生新的超分子结构的方式，这将为产生天然骨细胞外基质成分的复杂组合和梯度提供一种途径。

刺激响应性水凝胶：可分为机械、化学、热、pH和光响应性水凝胶。通过战略性地放置具有不同刺激响应的水凝胶，可以形成具有形状变化能力的生物打印构建体。此外，通过引入细胞响应位点，可以定制水凝胶支架的降解。

生物反应器的发展：未来的研究将集中在更复杂的机械系统上，以模拟体内自然组织的机械加载条件。例如，Shahin等人表明，人类软骨细胞受益于间歇无限制剪切和压缩加载的组合应用，同时产生的糖胺聚糖和II型胶原蛋白增加。未来可能会出现3D生物打印多细胞负载支架用于心脏组织工程，结合复杂的生物反应器，提供生化、机械、电和灌注等不同刺激，在生物反应器系统中进行体外支架成熟后，形成完整的功能性心脏。

参考文献：

Zhang J, et al. 3D Bioprinting of Human Tissues: Biofabrication, Bioinks, and Bioreactors. Int J Mol Sci. 2021 Apr 12;22(8):3971.