角膜移植难题现，传统方式缺陷显，创新水凝胶破局

       大家好！今天来了解一篇天然聚合物衍生光固化生物粘附水凝胶研究——《Natural polymer-derived photocurable bioadhesive hydrogels for sutureless keratoplasty》发表于《Bioactive Materials》。本文介绍了一种用于无缝合角膜移植术的天然聚合物衍生光固化生物粘附水凝胶。该水凝胶由明胶甲基丙烯酰基和氧化葡聚糖组成，具有高透光率、抗酶降解和良好生物相容性等优点，为角膜移植提供了新的选择。一起看看吧！

*本文只做阅读笔记分享*

一、研究背景

角膜是眼球前部的透明层，对于视力至关重要。然而，各种疾病可能导致角膜瘢痕，进而引起视力障碍甚至失明。角膜移植是治疗角膜盲患者视力康复的主要方法，但传统的缝合方法存在诸多问题，如耗时、需要高超技能以及可能引发多种并发症，包括感染性角膜炎、无菌性浸润、角膜新生血管形成和高度散光等。因此，无缝合角膜移植术成为研究热点。

目前的角膜粘合剂虽然取得了一定进展，但仍然存在不足，如氰基丙烯酸酯有毒性、缺乏透明度和柔韧性，纤维蛋白胶粘附力低等。近年来，粘附性水凝胶在伤口闭合中显示出有效性，本研究旨在开发一种满足角膜移植需求的生物粘附水凝胶。

二、实验方法与结果

（一）材料

购买了GelMA（EFL-GM-60，60%接枝度）、锂苯基-2,4,6-三甲酰基次膦酸盐（LAP）、葡聚糖、NaIO4、二甘醇等材料，以及细胞培养相关试剂和检测试剂盒，如Calceinacetoxymethyl（calceinAM）和ethidiumhomodimer-1LIVE/DEADassaykit、CCK-8assaykit等。

（二）合成ODex和制备生物粘附水凝胶

1、ODex的合成

按照报道方法合成ODex。将2g葡聚糖溶解在水中，浓度为10%（w/v），加入1.6g NaIO4，在室温下避光搅拌3h，然后加入等摩尔量的二甘醇，反应溶液用去离子水透析3天，最后通过冻干得到ODex粉末，并测量其氧化程度（OD）。

2、生物粘附水凝胶的制备

将LAP溶解在PBS中，浓度为0.25%（w/v），加热至55°C确保完全溶解。将GelMA粉末分别以5%、10%和20%（w/v）的浓度溶解在LAP溶液中，然后加入不同量的ODex，形成质量比为GelMA:ODex分别为5:0（G5）、10:0（G10）、20:0（G20）、5:5（G5OD5）、10:5（G10OD5）和20:5（G20OD5）的预水凝胶。预水凝胶在37°C孵育10min形成Schiff碱，然后用405nm可见光（30mW/cm²）光交联4min形成水凝胶。

（三）性能检测

1、微观形态分析

通过扫描电子显微镜（SEM，EVO18；Zeiss，Germany）观察水凝胶的微观结构。将冻干样品固定在铝制短棒上，喷镀铂70s后进行检测，可以看到随着GelMA浓度增加和ODex的加入，水凝胶的孔径减小，结构更加致密。

2、光学性质评估

制备矩形水凝胶（长3cm，宽1cm，厚100μm），测试前将样品浸泡在PBS溶液（pH=7.4）中1h。使用UV3802紫外-可见分光光度计（ShanghaiUNIC，Shanghai，China）在37°C下测量400-800nm范围内的光透射率。结果表明，水凝胶在可见光范围内透光率高于90%，接近天然角膜。

3、含水量测定

将水凝胶浸泡在PBS溶液I（pH=7.4）中，一定时间后取出，用滤纸吸干表面水分，测量湿样品重量（Mt），根据公式Wt = (Mt-M0)/M0×100%计算膨胀率，其中M0为膨胀前的初始重量。结果显示，随着GelMA浓度增加和ODex的引入，膨胀率降低。

4、酶抗性检测

评估水凝胶在胶原酶溶液中的抗降解能力。将约200mg样品在含有5mM CaCl2的0.1M Tris-HCl缓冲液（pH7.4）中于37°C平衡1h，然后加入胶原酶溶液，使其终浓度为1mg/mL，每8h更换一次胶原酶溶液。在不同时间间隔取出样品，称重，根据公式剩余质量百分比=Wt/W0×100%计算剩余质量百分比，其中W0为水凝胶的初始重量，Wt为每个时间点水凝胶的重量。结果表明，水凝胶对胶原酶的抵抗力随GelMA浓度和ODex的增加而提高，降解时间延长。

5、机械性能测试

制备矩形水凝胶（长3cm，宽1cm，厚100μm），测试前将样品浸泡在PBS溶液（pH=7.4）中1h，然后用超级胶水将样品两端粘在玻璃片上，用单轴载荷测试仪（Model#5567；InstronCorporation，Issaquah，WA，USA）测量拉伸强度、弹性模量和断裂伸长率，十字头速度为5mm/min，初始夹头间距为10mm。结果显示，G20OD5水凝胶具有最高的拉伸强度、杨氏模量和较好的弹性。

6、体外粘附试验

剪切粘附强度测试：测试水凝胶与玻璃之间的剪切粘附强度，并与纤维蛋白胶进行比较。将两块玻璃（长7.6cm，宽2.6cm）涂上20%（w/v）的明胶溶液，在37°C下晾干，然后在两块玻璃之间滴加25μL预水凝胶溶液或混合纤维蛋白胶，进行光交联，测量剪切粘附强度。结果表明，水凝胶的剪切粘附强度随GelMA浓度和ODex的增加而显著提高，G20OD5表现出最佳的剪切粘附强度。

体外爆破压力试验：在猪眼上进行体外爆破压力试验。从新鲜猪眼中切取角膜巩膜纽扣，安装在Barron人工前房上，在中央角膜制作一个4-mm穿透切口，在切口处涂抹15μL预水凝胶，原位交联4 min，然后将人工前房连接到压力计和注射器输液泵，以5mL/h的速度向人工前房注入生理盐水，测量最大压力。结果显示，G20OD5水凝胶的爆破压力远高于纤维蛋白胶，能够承受较高的眼压。

7、体外细胞研究

细胞培养：使用L929细胞（ATCC）和兔角膜成纤维细胞进行细胞研究。L929细胞在含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的Dulbecco’smodifiedEagle'smedium（DMEM）中培养，兔角膜成纤维细胞从新鲜新西兰兔角膜中分离，在含10%FBS和1%青霉素/链霉素的DMEM中培养。

细胞相容性评估：

1）二维培养：将预水凝胶过滤后加入组织培养板，光交联，然后将L929细胞接种在水凝胶上，培养2天后更换培养基，用LIVE/DEADassaykit评估细胞活力，用倒置荧光显微镜观察细胞。结果表明，L929细胞在水凝胶上生长良好，细胞活力高。

2）三维培养：将L929细胞重悬在无菌预水凝胶中，加入组织培养板，光交联形成细胞封装，培养2天后更换培养基，用CCK-8assaykit评估细胞增殖。结果显示，细胞在水凝胶中增殖正常。

3）基因表达分析：提取兔角膜成纤维细胞的总RNA，用PrimerScriptRTMasterMix合成cDNA，用SYBRGreenSupermix进行qPCR，分析肌成纤维细胞相关基因Collagen1A1、Collagen3A1、FibronectinA1和TGF-β1的表达水平。结果表明，在G20OD5浸出液中培养的细胞未出现过度的肌成纤维细胞转化。

（四）动物研究

1、手术过程

对8-12周龄的雄性新西兰白兔进行板层角膜移植术。在全身麻醉和局部麻醉下，使用6.75mm环钻在中央宿主角膜进行部分厚度环钻，手动去除前角膜基质至约2/3深度，用生理盐水冲洗受体基质床，制备0.25-mm超大的供体角膜透镜，在受体基质床上涂抹约25μL暂时制备的预水凝胶，将供体透镜转移到受体床上，调整位置后进行光聚合，术后给动物佩戴伊丽莎白项圈，并每天使用0.3%妥布霉素眼膏一次，持续一周。

2、术后评估

裂隙灯、AS-OCT和共聚焦显微镜评估：每周使用裂隙灯生物显微镜评估移植片附着、角膜透明度和其他病理变化，使用荧光素染色评估角膜上皮缺损，用光谱域AS-OCT获取角膜组织的横截面图像评估移植片附着，在全身麻醉下使用体内共聚焦显微镜评估角膜细胞变化和炎症状态。结果显示，术后角膜保持透明，移植片附着良好，上皮细胞快速再生。

组织学和SEM评估：术后8周处死兔子，取角膜组织进行常规石蜡包埋，制作5μm厚的切片，用苏木精-伊红（H&E）染色，在光学显微镜下观察，同时取角膜组织进行SEM扫描。结果表明，移植的角膜与受体床紧密结合，界面无间隙和碎片，炎症细胞浸润和瘢痕形成不明显，水凝胶在界面处几乎完全降解。

三、研究结论

开发的光固化生物粘附水凝胶具有理想角膜粘合剂的特性，可避免角膜移植术中缝合的需要。该水凝胶具有高透光率、抗酶抗性和良好的生物相容性，且粘附力强于商业纤维蛋白胶。水凝胶通过最终降解支持移植物-受体角膜整合，使角膜保持透明和无炎症，是角膜移植和其他组织粘附手术中缝合的有吸引力的替代品。

四、一起来做做题吧

1、全球大约有多少人因角膜透明度改变而有中度至重度视力受损？

A. 3.5 million

B. 4.5 million

C. 5.5 million

D. 6.5 million

2、角膜移植通常采用什么方法将供体角膜与受体角膜床连接？

A. 胶水粘贴

B. 缝合

C. 激光焊接

D. 自然融合

3、在合成 ODex 的过程中，加入后溶液需要搅拌多长时间？

A. 1h

B. 2h

C. 3h

D. 4h

4、制备生物粘附水凝胶时，将 GelMA 粉末溶解在 LAP 溶液中的浓度不包括以下哪个？

A. 3%

B. 5%

C. 10%

D. 20%

5、以下关于生物粘附水凝胶的光学性质描述正确的是？

A. 在可见光范围内透光率低于 80%

B. 在 400 - 800nm 范围内透光率高于 90%

C. 黄色转变严重影响其透光率

D. 透光率与天然角膜相比差很多

6、哪种水凝胶配方具有最高的拉伸强度？

A. G5

B. G10

C. G20

D. G20OD5

7、体外细胞研究中，用于细胞毒性测试的细胞系是？

A. 兔角膜成纤维细胞

B. 人角膜上皮细胞

C. 小鼠 L929 纤维肉瘤细胞

D. 大鼠心肌细胞

8、在 G20OD5 浸出液中培养兔角膜成纤维细胞，哪种情况未出现？

A. 细胞活力降低

B. 过度的肌成纤维细胞转化

C. 细胞增殖加快

D. 细胞凋亡增加

9、在兔板层角膜移植模型中，术后角膜上皮细胞缺陷在多长时间内完全愈合？

A. 1 天

B. 3 天

C. 7 天

D. 14 天

10、术后通过什么方法观察到角膜细胞变化和炎症状态？

A. 裂隙灯生物显微镜

B. 体内共聚焦显微镜

C. 光谱域 AS - OCT

D. 电子显微镜

参考文献：

Zhao X, et al. Natural polymer-derived photocurable bioadhesive hydrogels for sutureless keratoplasty. Bioact Mater. 2021 Jul 6;8:196-209.