冲12分top刊｜乳腺癌单细胞细分亚型的正确打开方式

说在前面

学习一下一篇自测数据工作量叠满的单细胞文章，也算是多组学的了，bulkRNA+scRNA，还有个伪RNA。

整体是一个单细胞分小群的研究思路，分出三种上皮细胞亚群（BM、LP、ML），在功能、免疫、预后等鉴定出PLK1，再于体内外实验验证

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今天给大家分享的一篇文章：Single-cell analyses reveal evolution mimicry during the specification of breast cancer subtype

• 标题：单细胞分析揭示乳腺癌亚型形成过程中的进化模仿
• 期刊名称：Theranostics
• 影响因子：12.4
• JCR分区：Q1
• 中科院分区：医学1区 Top
• 小类：医学：研究与实验1区

摘要

背景：干细胞或祖细胞前体通过遗传和表观遗传程序赋予癌细胞发育可塑性和独特的细胞身份。目前仍未利用新技术对乳腺癌细胞来源进行全面表征和定位，以揭示新的亚型特异性治疗靶点。

方法：我们整合了来自正常乳腺组织的 195,144 个高质量细胞和来自原发性乳腺癌样本的 406,501 个高质量细胞，以创建人类正常和癌变乳腺的大规模单细胞图谱。通过将癌细胞与参考正常上皮细胞进行对比，探索恶性细胞的潜在异质性来源。进行了多组学分析和体外和体内实验，以筛选和验证潜在的亚型特异性治疗靶点。在我们的队列中，通过免疫组织化学验证了已鉴定的免疫和基质细胞亚群的新生物标志物。

结果：基于癌细胞来源模式的肿瘤分层与临床结果、基因组畸变和不同的微环境构成相关。我们发现管腔祖细胞 (LP) 亚型与不良预后、基因组不稳定性和功能失调的免疫微环境密切相关。然而，LP 亚型患者对新辅助化疗 (NAC)、PARP 抑制剂 (PARPi) 和免疫疗法敏感。通过体外和体内实验研究了 LP 亚型特异性靶标 PLK1。此外，乳腺癌的大规模单细胞分析启发我们识别一系列临床相关的免疫和基质细胞亚群，包括先天淋巴细胞 (ILC)、巨噬细胞和内皮细胞的亚群。

结论：本单细胞研究揭示了乳腺癌的细胞库和细胞来源模式。结合单细胞和大量转录组数据，我们阐明了从正常亚型到恶性亚型的进化模拟，并阐述了具有重要临床意义的 LP 亚型。我们研究中发现的乳腺癌新免疫和基质细胞亚群可能是潜在的治疗靶点。总之，我们的研究结果为乳腺癌的精确预后和治疗分层奠定了基础。

关键词：乳腺癌、单细胞 RNA 测序、肿瘤细胞来源、分子亚型、肿瘤微环境

结果

图1
人类正常和癌变乳腺的大规模综合细胞图谱。

• （A）研究设计和分析示意图。
• （B）对来自 35 种正常乳腺组织的 195,144 个细胞进行综合分析。
• （C）气泡热图显示正常乳腺组织中选定特征基因的表达水平。点大小表示表达细胞的比例，根据平均标准化表达水平着色。
• （D）对来自 181 个原发性乳腺肿瘤的 406,501 个细胞进行综合分析。
• （E）气泡热图显示乳腺肿瘤中选定特征基因的表达水平。点大小表示表达细胞的比例，根据平均标准化表达水平着色。

图 2
乳腺癌细胞与正常乳腺上皮细胞亚型的比对。

• （A）UMAP 图显示正常乳腺组织中上皮细胞的主要谱系。
• （B）115 个乳腺肿瘤伪块体图与七个参考正常乳腺上皮伪块体图相结合的聚类，根据常见特征基因的表达显示三大谱系。
• （C）UMAP 图显示三大乳腺癌细胞谱系中的 20 个乳腺肿瘤亚群。
• （D）箱线图显示三大谱系中乳腺癌细胞的细胞纯度。Kruskal-Wallis 检验。
• （E）小提琴图显示三大谱系乳腺癌细胞的 CNV 评分分布。Kruskal-Wallis 检验。
• （F）热图显示 20 个乳腺肿瘤亚群中 16 个复发性癌细胞基因模块的不同表达模式。
• （G）热图显示 20 个乳腺肿瘤亚群中标志性基因集的不同表达模式。

图 3
LP 亚型乳腺癌的分子和临床特征。

• （A）堆叠条形图显示 METABRIC 队列中乳腺肿瘤的反卷积结果。条形的颜色表示三种细胞谱系，如图例所示。y 轴代表给定大块肿瘤样本中每种细胞谱系的比例。在 x 轴内，每列代表一个肿瘤病例。上方的注释栏表示由每个肿瘤内的主要细胞谱系定义的大块肿瘤的分子亚型，其中黄色代表多种细胞谱系的混合。
• （B）Kaplan-Meier 图显示 METABRIC 队列中 LP 亚型患者的临床结果较差。使用对数秩检验计算P值。
• （C）LP 评分与多种突变特征之间的 Spearman 相关性。相关性P < 0.05 用星号标记。
• （D）小提琴图比较 TCGA 中 LP-low 和 LP-high 乳腺肿瘤之间的 HRD 评分。非配对双侧 Wilcoxon 检验。
• (E) 小提琴图比较对 NAC 治疗反应不同的乳腺肿瘤的 LP 评分表达水平。非配对双侧 Wilcoxon 检验。
• (F) 小提琴图比较 I-SPY2 队列中对 PARP 抑制剂治疗反应不同的乳腺肿瘤的 LP 评分表达水平。非配对双侧 Wilcoxon 检验。
• (G) 气泡热图显示通过 GSEA 在高 LP 比例的乳腺肿瘤中富集的上调通路。点大小表示归一化富集分数 (NES)，根据调整后的P值着色。
• (H) 小提琴图比较 TCGA 中 LP-低和 LP-高乳腺肿瘤之间的 T 细胞耗竭特征分数。非配对双侧 Wilcoxon 检验。
• (I) 小提琴图比较对抗 PD1 治疗反应不同的乳腺癌患者的 LP 评分表达水平。非配对双侧 Wilcoxon 检验。
• (J) 乳腺组织微阵列的 PSAT1、ER 和 CK14 免疫组织化学检测。
• (K) 乳腺癌患者中 PSAT1高/ER低/CK14低的 LP 亚型与 DFS 较差相关。使用对数秩检验计算P值。

图 4
识别 LP 亚型乳腺癌中的潜在治疗靶点。

• (A) 维恩图显示了通过 scRNA-seq、bulk RNA-seq 和 Perturb-seq 数据识别的驱动 LP 亚型乳腺癌内染色体不稳定性的独特基因和共享基因。
• (B) 散点图显示通过 scRNA-seq、bulk RNA-seq 和 Perturb-seq 数据识别的 260 个常见基因的等级得分。突出显示了前 10 个基因。
• © 散点图显示 CCLE 中不同乳腺癌细胞系的 LP 得分。突出显示了 SUM-149PT 和 MCF-7 细胞系。
• (D) SUM-149PT 和 MCF-7 细胞中选定候选基因（PLK1、TPX2、CDK1和AURKA ）敲低的相对细胞活力水平。
• (E) PLK1敲低的 SUM-149PT 和 MCF-7 细胞的凋亡率水平。
• (F) PLK1敲低和对照载体在 SUM-149PT 和 MCF-7 细胞中的吉姆萨染色代表性图像。
• (G) PLK1敲低和对照载体的 SUM-149PT 肿瘤图片。
• (H) 注射了PLK1敲低和对照载体的 SUM-149PT 细胞的小鼠的肿瘤生长曲线。
• (I) 显示了PLK1敲低和对照载体的SUM-149PT 肿瘤的重量分布。
• (J) 曲线显示用不同剂量的 volasertib 治疗后 SUM-149PT 和 MCF-7 细胞的相对细胞活力。
• (K) 用高剂量和低剂量的 volasertib 治疗后 SUM-149PT 和 MCF-7 细胞的凋亡率水平。
• (L) 用高剂量和低剂量的 volasertib 和对照载体治疗后 SUM-149PT 肿瘤图片。
• (M) 注射 SUM-149PT 肿瘤的小鼠在接受高剂量和低剂量 volasertib 以及对照载体治疗后肿瘤生长曲线。
• (N) 接受高剂量和低剂量 volasertib 以及对照载体治疗后 SUM-149PT 肿瘤的重量分布。

图 5
淋巴细胞、NK 细胞和 ILC 的综合分析。

• (A) UMAP 图显示 T 细胞和 ILC 的不同亚群。
• (B) 气泡热图显示 T 细胞和 ILC 中选定特征基因的表达水平。点大小表示表达细胞的比例，颜色基于平均标准化表达水平。
• © 条形图显示不同分子亚型中主要 T/ILC 细胞类型的相对比例。
• (D) 小提琴图显示不同 T/ILC 亚群中代表性的幼稚、细胞毒性、耗竭和 Treg 特征。红色虚线表示中位模块得分。
• (E) UMAP 图显示 NK/ILC 细胞的三个主要亚群。
• (F) 小提琴图显示 NK/ILC 细胞中选定特征基因的表达水平。
• (G) 使用每个 NK/ILC 亚群中前 50 个显着表达基因进行 GO 富集分析。
• (H) Kaplan-Meier 图显示 METABRIC 队列中 ILC3_IL7R 亚群组成较高的乳腺癌患者的临床结果更好。P值使用对数秩检验来计算。

图 6
乳腺癌中的髓系细胞异质性。

• （A）UMAP 图显示髓系细胞的不同亚群。
• （B）气泡热图显示髓系细胞中选定特征基因的表达水平。点大小表示表达细胞的比例，颜色基于平均标准化表达水平。
• （C）条形图显示不同分子亚型中主要髓系细胞类型的相对比例。
• （D）UMAP 图显示七种主要的巨噬细胞亚群。
• （E）小提琴图显示巨噬细胞中选定特征基因的表达水平。
• （F）条形图显示 GSVA 对每个细胞评分的 CKB +巨噬细胞中富集的不同途径。t 值使用 limma 回归计算。
• （G）乳腺组织微阵列的 CKB 免疫组织化学。
• （H）Kaplan-Meier 图显示我们的 IHC 队列中 CKB 表达较高的乳腺癌患者的临床结果较差。使用对数秩检验计算P值。
• (I) Kaplan-Meier 图显示，IMvigor210 数据集中，接受抗 PD1 治疗且 CKB +巨噬细胞亚群组成较高的患者的临床结果较差。使用对数秩检验计算P值。

图 7
正常和癌变乳腺组织中的内皮细胞景观。

• （A）UMAP 图显示正常和癌变乳腺组织中 EC 的不同亚群。
• （B）小提琴图显示正常和癌变乳腺组织中 EC 中选定特征基因的表达水平。
• （C）UMAP 图显示乳腺癌 EC 的不同亚群。
• （D）小提琴图显示乳腺癌 EC 中选定特征基因的表达水平。
• （E）条形图显示不同分子亚型中主要乳腺癌 EC 类型的相对比例。
• （F）Kaplan-Meier 图显示METABRIC 队列中CA4 +毛细血管亚群组成较高的乳腺癌患者的临床结果更好。使用对数秩检验计算P值。
• （G）乳腺组织微阵列的 CA4 免疫组织化学。
• （H）Kaplan-Meier 图显示我们的 IHC 队列中 CA4 表达较高的乳腺癌患者的临床结果更差。使用对数秩检验计算P值。
• (I) 小提琴图比较 I-SPY2 队列中对抗血管生成治疗反应不同的乳腺癌患者中血管生成毛细血管细胞标志基因的表达水平。非配对双侧 Wilcoxon 检验。
• (J) 小提琴图比较对抗 PD1 治疗反应不同的乳腺癌患者中血管生成毛细血管亚群的表达组成。非配对双侧 Wilcoxon 检验。
• (K) Kaplan-Meier 图显示 IMvigor210 数据集中接受抗 PD1 治疗且血管生成毛细血管亚群组成较高的患者的临床结果较差。使用对数秩检验计算P值。

小结

• 主要数据及方法：

Types	Notes
分析数据	组织：219例组织微阵列；scRNA：35个Normal+181个Tumor样本；bulkRNA：TCGA、GSE163882、GSE194040
分析方法	单细胞标准流程；细分小群；bulk反卷积；infercnv作CNV估计；GSVA富集；LP得分相关性计算；表达表征可视化；SCENIC 分析；生存分析；单细胞亚群异质性
实验技术	免疫组化染色；细胞系细胞培养；转染；基因敲降；定量PCR；磺酰罗丹明 B 检测；细胞凋亡分析；动物实验常规给药对照等