易基因：ChIP-seq等揭示转录因子NRF1调控原始生殖细胞发育、增殖和存活的表观遗传机制｜科研进展

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原始生殖细胞（Primordial germ cell，PGC）是生殖细胞前体，可以产生卵母细胞和精子，确保生命延续。尽管PGC特化（PGC specification）得到广泛研究，但PGC种群在出生前迁移到胚胎性腺后如何维持和扩大仍然难以捉摸。转录因子（如PRDM1/BLIMP1、PRDM14和TFAP2C）和信号分子（如BMP和WNT）在PGC特化中发挥着至关重要的作用。核呼吸因子1（Nuclear respiratory factor 1，NRF1）是一种已知参与线粒体生物发生的转录因子。最近研究表明，在精子发生过程中，NRF1与生殖细胞特异性基因CpG富集的低甲基化启动子区结合，并直接激活其转录。目前研究揭示与周围的体细胞相比，胚胎期迁移后的PGC中NRF1高表达，可能是由于PGC基因组逐渐低甲基化。此外，NRF1是PGC体外和体内增殖和存活所必需的，且当异位表达时，NRF1积极促进PSC分化。

2023年8月4日，华东师范大学生命科学学院研究生王鹏翔等为第一作者在《Cell Proliferation》杂志发表题为“NRF1 promotes primordial germ cell development, proliferation and survival”的研究论文，该研究以原始生殖细胞（PGC）为研究对象，通过RNA-seq和ChIP-seq等实验表明NRF1通过调控支持PGC编程的广泛转录网络和线粒体代谢，参与调控迁移后PGC存活和增殖。本研究为PGC发育背后的功能机制提供了新的线索，并验证NRF1是此过程中以前未被鉴定的调控因子。

标题：NRF1 promotes primordial germ cell development, proliferation and survival（NRF1促进原始生殖细胞的发育、增殖和存活）

时间：2023-08-04

期刊：Cell Proliferation

影响因子：IF 8.5

技术平台：ChIP-seq、RNA-seq、Western blot、qRT-PCR等

研究摘要：

NRF1是一种已知的线粒体代谢调控因子，在PGC迁移后发育中起着关键作用。本研究结果表明，在胚胎发育过程中，NRF1蛋白水平在PGC迁移后逐渐升高。胚胎生殖细胞的特异性Nrf1敲除导致PGC增殖和存活受损。此外，NRF1还可以主动促进多能干细胞的PGC分化。通过全转录组分析和ChIP-seq分析进一步发现NRF1直接调控PGC形成中的关键信号分子、增殖和细胞周期中的转录因子以及线粒体代谢中的酶。总的来说，本研究结果强调了NRF1调控广泛转录网络以支持体外和体内迁移后PGC发育。

研究结果

（1）生殖细胞中特异性Nrf1敲除破坏迁移后PGC发育

图1：NRF1为原始生殖细胞（PGC）发育所必需。

（A） 用NRF1和OCT4抗体在E9.5小鼠胚胎上通过免疫组织荧光（IHF）检测PGCs中NRF1表达。

（B） 用NRF1抗体和生殖细胞特异性蛋白DDX4抗体对E11.5–15.5胚胎性腺进行IHF测定。（A-B）比例尺：50 μm。插入显示了代表性区域放大图像。

（C-D） 通过PGCs中的Tnap-Cre对野生型对照胚胎和Nrf1特异性敲除胚胎（Nrf1−/f-Cre）的E11.5–13.5性腺进行IHF测定，抗Nrf1和OCT4抗体（C），抗Nrf1和DDX4抗体（D），用细胞核染料DAPI复染。比例尺：15 μm。（C）白色箭头表示NRF1表达完全消失的OCT4+ PGC。

（2）PGCs中Nrf1缺失导致雄性和雌性小鼠不孕

图2：Nrf1基因敲除导致雄性和雌性小鼠不孕。

（A） Nrf1−/f-Cre小鼠及其野生型同窝出生对照小鼠在P0和7周龄的睾丸形态。

（B） Nrf1−/f-Cre小鼠及其野生型同窝出生对照小鼠在8周龄时睾丸和附睾的组织学研究。

（C） Nrf1−/f-Cre小鼠及其野生型同窝出生对照小鼠7周龄的卵巢形态比较。

（D） Nrf1−/f-Cre小鼠及其野生型同窝出生对照小鼠7周龄的卵巢切片组织学研究。黑色箭头和数字表示卵泡的不同发育时期。1：原代卵泡；2：次生卵泡；3：黄体。

（3）NRF1缺失破坏了迁移后PGCs的存活和增殖

图3：NRF1是迁移后原始生殖细胞（PGCs）增殖和存活所必需的。

（A） 用p20-GFP或p20-Cre-p2a-GFP诱导分化的Nrf1f/f PSC的流式细胞术分析。通过SSEA1染色检测GFP+PGC样细胞（PGCLCs），右侧显示GFP+/SSEA1+PGCLC百分比。

（B） 使用BV421标记的抗Ki67抗体通过流式细胞术分析（A）的GFP+/SSEA1+PGCLC。

（C） 将（A）的GFP+/SSEA1+PGCLC与BV421标记的膜联蛋白V和碘化丙啶（PI）共染色，然后通过流式细胞术分析样品。（A–C）数据以三次独立的生物学重复的平均值±SEM表示。***：p<0.001.

（D-E） E11.5时Nrf1−/f-Cre胚胎及其野生型同窝同伴小鼠生殖嵴上的免疫组织荧光（IHF），使用抗OCT4和Ki67的抗体（D），或OCT4和裂解的Caspase 3（CASP3）抗体（E）。白色箭头表示Nrf1−/f-Cre胚胎中的OCT4+/Ki67非增殖PGCs（D）或OCT4+/Caspase3+凋亡PGCs（E）。比例尺：10 μm。

（4）NRF1过表达促进PSC PGCLC形成

图4：NRF1促进PSC形成PGC样细胞（PGCLC）。

（A） 通过real-time RT-PCR检测BV+PGCLC中Nrf1和原始生殖细胞（PGC）标记基因的相对mRNA水平，与从BVSC PSC分化的BV−体细胞进行比较。

（B） 与对照组（Ctrl）相比，内源性Nrf1激活（Nrf1a）时通过流式细胞术检测BV+PGCLC。

（C） 内源性Nrf1激活后，通过real-time RT-PCR检测第6天EB的相对mRNA水平。（A–C）数据以两次独立的生物学重复的平均值±SEM表示。

（D） BVSC PSCs分化第5天的流式细胞术分析。在PSC分化的第2-5天，通过DOX处理诱导NRF1表达（p20-NRF1）。使用相同DOX处理的空载体作为对照（p20）。左图为流式细胞术的代表性结果，中间panel为BV+PGCLC百分比。右图为BVSC PSC分化第5天EB的代表性图像。

（E） real-time RT-PCR检测第5天分化的EBs中Nrf1和PGC标记基因的mRNA水平。在PSC分化的第2-5天，通过DOX处理诱导NRF1表达。（D–F）数据以三次独立的生物学重复的平均值±SEM表示。（A-F）*：p<0.05；**：p<0.01.***：p<0.001。N.S.：无显著性。

（5）NRF1是直接调控PGC形成、线粒体代谢和细胞增殖的关键基因

图5：NRF1调控转录网络，诱导PSCs分化为PGC样细胞（PGCLC）

（A） RNA-seq分析中差异表达基因的Venn图，Log2倍数变化>0.58，p<0.05。

（B） 有或无NRF1过表达（OE）的BV+PGCLC的RNA-seq分析检测到的基因火山图。

（C） 有或无NRF1-OE的BV+PGCLC差异表达基因的GO分析（Log2倍数变化>0.58，p<0.05）。（D） 对DOX诱导的NRF1-OE（p20-NRF1）或空载体对照（p20）的BV+PGCLC的real-time RT-PCR分析。数据以三次独立的生物学重复的平均值±SEM表示。*: p < 0.05;**: p < 0.01。***: p < 0.001。

图6：原始生殖细胞（PGCs）NRF1介导的转录网络特征。

（A） 从BV+PGC样细胞（PGCLCs）中进行的ChIP-seq分析中获得的NRF1结合motif。

（B） 从ChIP-seq分析中获得的基因组区域NRF1结合位点分布。

（C） BV+PGCLC中NRF1结合的靶基因的GO分析。

（D） ChIP-seq分析的基因组区域中NRF1靶基因启动子区域的代表性peaks。

（E） 用NRF1抗体或IgG对照对BV+PGCLC的免疫沉淀的基因组DNA进行实时PCR分析。数据以三次独立的生物学重复的平均值±SEM表示。*：p<0.05；**：p<0.01.***：p<0.001。

关于易基因染色质免疫共沉淀测序 (ChIP-seq)

染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation,ChIP），是研究体内蛋白质与DNA相互作用的经典方法。将ChIP与高通量测序技术相结合的ChIP-Seq技术，可在全基因组范围对特定蛋白的DNA结合位点进行高效而准确的筛选与鉴定，为研究的深入开展打下基础。

DNA与蛋白质的相互作用与基因的转录、染色质的空间构型和构象密切相关。运用组蛋白特定修饰的特异性抗体或DNA结合蛋白或转录因子特异性抗体富集与其结合的DNA片段，并进行纯化和文库构建，然后进行高通量测序，通过将获得的数据与参考基因组精确比对，研究人员可获得全基因组范围内某种修饰类型的特定组蛋白或转录因子与基因组DNA序列之间的关系，也可对多个样品进行差异比较。

应用方向：

ChIP 用来在空间上和时间上不同蛋白沿基因或基因组定位

• 转录因子和辅因子结合作用
• 复制因子和 DNA 修复蛋白
• 组蛋白修饰和变异组蛋白

技术优势：

• 物种范围广：细胞、动物组织、植物组织、细菌微生物多物种富集经验；
• 微量建库：只需5ng以上免疫沉淀后的DNA，即可展开测序分析；
• 方案灵活：根据不同的项目需求，选择不同的组蛋白修饰特异性抗体。

技术路线：

易基因提供全面的DNA与蛋白互作测序方案，详询易基因：0755-28317900。

参考文献：

Wang P, Su J, Wang J, Xie Y, Chen W, Zhong J, Wang Y. NRF1 promotes primordial germ cell development, proliferation and survival. Cell Prolif. 2023 Aug 4:e13533.

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